СПОСІБ ДЕТЕКЦІЇ ПОЛІМОРФІЗМУ ДРУГОГО ІНТРОНА ГЕНА LEAFY ДЛЯ ДНК-БАРКОДИНГУ ІНВАЗІЙНИХ ВИДІВ РОДУ REYNOUTRIA

Спосіб детекції поліморфізму другого інтрона гена LEAFY для баркодингу інвазійних видів роду Reynoutria, що включає приготування реакційної суміші, активацію полімерази, гібридизацію праймерів, котрі комплементарні до фланкуючих другий інтрон ділянок другого та третього екзонів, очистку та секвенування отриманих ПЛР-продуктів, який відрізняється тим, що в реакційні суміші додають універсальні для всіх варіантів LEAFY праймери: lfyR-F-AA-5'-AAG-GAG-ACA-AGT-GCC-CCA-CTA-AGG-3', lfyR-F-GG-5'-GGG-GAG-ACA-AGT-GCC-CCA-CTA-AGG-3', lfyR-R-AA-5'-AAC-TGA-ACA-CTT-GGT-TTG-TTA-CCT-GG-3' і lfyR-R-GG-5'-GGC-TGA-ACA-CTT-GGT-TTG-TTA-CCT-GG-3' у чотирьох різних комбінаціях, після ампліфікації змішують ПЛР-продукти, ампліфіковані на різних комбінаціях праймерів в еквімолярній концентрації та секвенують змішані амплікони методом Illumina.

Корисна модель належить до галузі молекулярної генетики та може бути використана для таксономічної ідентифікації видів і гібридних форм інвазійних представників роду Reynoutria, визначення генетичної композиції поліплоїдних форм, а також у екологічних, природоохоронних, ботанічних дослідженнях та інших сферах практичної діяльності, які потребують високоточної ідентифікації близькоспоріднених форм та гібридів інвазійних рослин. Ген LEAFY(LFY), також відомий як FLORICAULAIFLO, кодує регулятор транскрипції, залучений у розвиток квіткової меристеми. LEAFY вважається унікальним або низькокопійним геном у більшості покритонасінних рослин. Структурна організація LEAFY є консервативною і включає три екзони та два інтрони. Другий інтрон гена LEAFY завдяки високій мінливості є ефективним інструментом філогенетичних досліджень [1]. Наявність алельних варіантів у геномі дозволяє застосовувати унікальні та низькокопійні послідовності ядерного геному для виявлення гетерозигот та гібридних форм. Послідовності інтронів гена LEAFY неодноразово успішно використовувалися для дослідження філогенії та ДНК-баркодингу гібридних форм різних таксонів рослин [7]. Представники роду Reynoutria належать до найбільш агресивних інвазійних видів рослин у світі та включені Міжнародним союзом охорони природи (IUCN) до списку 100 найнебезпечніших інвазійних видів [2]. Ці багаторічні трав'янисті рослини родини Polygonaceae характеризуються надзвичайно швидким вегетативним ростом, здатністю утворювати щільні зарості та високою конкурентоспроможністю. Інвазія видів Reynoutria призводить до витіснення аборигенних видів рослин, зниження біорізноманіття, порушення структури природних екосистем, а також завдає значних економічних збитків через пошкодження інфраструктури, зниження продуктивності сільськогосподарських угідь та необхідність проведення коштовних заходів з контролю їх поширення. Поза межами природного ареалу у Східній Азії цей рід представлений октаплоїдним (2n=8х) видом R. japonica Houtt, тетраплоїдним (2n=4х) R. sachalinensis (F. Schmidt) Nakai та похідними від них гібридними гексаплоїдними (2n=6х) формами, виділеними в окремий вид R. χ bohemica Chrtek & Chrtkova [5]. Гібридні форми часто характеризуються підвищеною життєздатністю та інвазійним потенціалом порівняно з батьківськими видами, що робить їх особливо небезпечними для природних екосистем. В Україні зафіксована активна інвазія всіх трьох видів, причому частка R. sachalinensis серед представників роду Reynoutria в Україні та в решті країн Східної Європи є значно вищою, порівняно з іншими частинами Європейського континенту [3]. Ефективний контроль інвазії представників роду Reynoutria потребує точної ідентифікації видів та гібридних форм, оскільки різні таксони можуть характеризуватися різною екологією та чутливістю до методів контролю. Морфологічна ідентифікація видів роду Reynoutria є складною через високу подібність та фенотипічну пластичність, особливо у випадку гібридних форм. Тому розробка надійних молекулярно-генетичних методів ідентифікації є критично важливою для моніторингу інвазійних популяцій, планування природоохоронних заходів та наукових досліджень біології інвазійних процесів. Зважаючи на високу генетичну подібність видів роду Reynoutria та поширеність гібридних форм між ними, актуальним завданням є розробка інформативного молекулярного маркера, використання якого дозволило б не лише розрізняти близькоспоріднені види, але й ідентифікувати наявність у геномі множинних варіантів послідовності, що є характерним для поліплоїдних та гібридних форм. Оптимальним кандидатом на роль такого маркера є послідовність другого інтрона гена LEAFY, яка була раніше розшифрована для великої кількості зразків Reynoutria різного географічного походження [1; 4; 5, 6]. Порівняння доступних в базах даних послідовностей цієї ділянки виявляє численні індели (інсерції/делеції) та інформативні нуклеотидні заміни, які дозволяють розрізняти як геноми окремих видів, так і субгеноми. Найбільш близьким аналогом, є використання для детекції внутрішньогеномного поліморфізму другого інтрона гена LEAFY наборів специфічних праймерів для селективної ПЛР-ампліфікації окремих варіантів послідовності з подальшим прямим секвенуванням ПЛР-продуктів за Сенгером [6]. Цей підхід передбачає створення специфічних пар праймерів для кожного з відомих варіантів послідовності (J1, J2, J3 для R.japonica та S1, S2 для R. sachalinensis) та проведення окремих ПЛР-реакцій для кожної пари праймерів. Недоліками близького аналогу є необхідність попереднього аналізу всіх можливих варіантів послідовності, неможливість виявлення нових варіантів, потреба у множинних паралельних ПЛР-реакціях, неможливість отримати інформацію стосовно кількісного співвідношення варіантів в геномі. З огляду на вищезазначені недоліки прототип не дозволяє ефективно проводити масштабні дослідження генетичної структури інвазійних популяцій Reynoutria. Задачею корисної моделі є створення ефективного, швидкого та економічно доступного методу для комплексного аналізу внутрішньогеномного поліморфізму другого інтрона гена LEAFY у представників роду Reynoutria з можливістю кількісної оцінки співвідношення різних варіантів послідовності в геномі та виявлення нових, раніше не описаних варіантів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб детекції поліморфізму другого інтрона гена LEAFY для баркодингу інвазійних видів роду Reynoutria, що включає приготування реакційної суміші, активацію полімерази, гібридизацію праймерів, котрі комплементарні до фланкуючих другий інтрон ділянок другого та третього екзонів, очистку та секвенування отриманих ПЛР-продуктів, згідно з корисною моделлю, в реакційні суміші додають універсальні для всіх варіантів LEAFY праймери: lfyR-F-AA-5'-AAG-GAG-ACA-AGT-GCC-CCA-CTA-AGG-3', lfyR-F-GG-5'-GGG-GAG-ACA-AGT-GCC-CCA-CTA-AGG-3', lfyR-R-AA-5'-AAC-TGA-ACA-CTT-GGT-TTG-TTA-CCT-GG-3' і lfyR-R-GG-5'-GGC-TGA-ACA-CTT-GGT-TTG-TTA-CCT-GG-3' у чотирьох різних комбінаціях, після ампліфікації змішують ПЛР-продукти, ампліфіковані на різних комбінаціях праймерів в еквімолярній концентрації та секвенують змішані амплікони методом Illumina. Завдяки використанню ПЛР-ампліфікації з подальшим NGS-секвенуванням ампліконів методом Illumina, яка включає наступні етапи: 1) виділення геномної ДНК; 2) ПЛР-ампліфікацію другого інтрона гена LEAFY з використанням універсальних праймерів lfyR-F та lfyR-R, які комплементарні до консервативних ділянок другого та третього екзонів гена LEAFY і здатні ампліфікувати всі можливі варіанти послідовності другого інтрона; 3) очищення ПЛР-продуктів; 4) секвенування ампліконів методом Illumina; 5) біоінформатичний аналіз отриманих послідовностей для ідентифікації гаплотипів та визначення їх кількісного співвідношення. Дизайн праймерів. Для ампліфікації другого інтрона гена LEAFY використовували розроблену нами пару універсальних олігонуклеотидних праймерів lfyR-F та lfyR-R, які гібридизуються з консервативними ділянками другого та третього екзонів, відповідно. Місця гібридизації праймерів обирали на основі аналізу вирівнювання послідовностей гена LEAFY з геномів представників роду Reynoutria, отриманих з бази даних GenBank. Для того, щоб забезпечити ампліфікацію всіх відомих для представників роду Reynoutria варіантів послідовності другого інтрона, обирали ділянки, у яких відсутні варіант-специфічні нуклеотидні заміни та індели. Для можливості секвенування ампліконів від різних зразків в одній реакції, на 5'-кінці праймерів були додані динуклеотидні послідовності-баркоди (GG та АА), які не комплементарні до матриці, а отже, не впливають на специфічність ампліфікації, проте дозволяють розрізняти зразки при біоінформатичному аналізі результатів секвенування. Праймери створювались за правилами молекулярного дизайну з використанням вбудованого інструменту "Pick primers" на сторінці нуклеотидної послідовності в базі даних GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=86778&INPUT_SEQUENCE=AB021027.1&LINK_LOC=nuccore). Характеристики запропонованих програмою пар праймерів додатково аналізували онлайн-інструментами "Tm Calculator" та "Multiple Primer Analyzer" на сервері ThermoFisher Scientific (https://www^hermofisherxom/ua/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html та https://www.thermofisher.corn/ua/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html). ТаблицяХарактеристики розроблених праймерів для ампліфікації другого інтрона гена LEAFYНазва праймераПослідовність праймераНапрямок ампліфікаціїТемпература плавлення, Тт °СGC-ВМІСТ, %Довжина праймера, нпlfyR-F-AA5'-aaggagacaagtgccccactaagg-3'прямий69,066,524lfyR-F-GG5'-ggggagacaagtgccccactaagg-3'прямий69,066,524lfyR-R-AA5'-aactgaacacttggtttgttacctgg-3'зворотній67,263,926lfyR-R-GG5'-ggctgaacacttggtttgttacctgg-3'зворотній67,263,926 Розроблені нуклеотидні послідовності продукувались методом хімічного синтезу праймерів та використовувалась для проведення ПЛР. Оптимальні умови ПЛР-ампліфікації, які забезпечували ефективність та високу специфічність, підбирались експериментально. ПЛР-продукти після завершення реакції аналізували методом гель-електрофорезу. Розроблений нами метод детекції внутрішньогеномного поліморфізму другого інтрона гена LEAFY для представників роду Reynoutria відрізняється від прототипів місцем гібридизації праймерів та методом секвенування ампліконів. Приклад конкретного виконання. Виділення загальної клітинної ДНК гербаризованих тканин двох зразків R. japonica та двох зразків R. R bohemica проводили модифікованим цетавлоновим методом [8]. Полімерність виділених препаратів ДНК оцінювали методом електрофорезу у 1 % агарозному гелі. Концентрацію ДНК та чистоту відносно таких забруднювачів, як білки та полісахариди, визначали спектрометричним методом за допомогою приладу NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, США). Полімерні препарати ДНК високої чистоти застосовували у якості матриці для ПЛР-ампліфікації з використанням праймерів чотирьох можливих комбінацій праймерів lfyR-F-ΑΑ, lfyR-F-GG, lfyR-R-AA і lfyR-R-GG та полімеразної суміші 5х FIREPol (Solis BioDyne, Естонія) згідно з рекомендаціями виробника та з урахуванням параметрів праймерів. Візуалізацію отриманих ПЛР-продуктів проводили методом електрофорезу у 2 % агарозному гелі. В результаті аналізу ПЛР-продуктів для всіх зразків була виявлена єдина смужка ДНК довжиною приблизно 600 нп. Чотири ПЛР-продукти змішували в еквімолярній концентрації і секвенували методом Illumina, з використанням сервісу Amplicon-EZ (GENEWIZ). Отримані послідовності рідів переводили у формат FASTA за допомогою програми SeqKit 0.15.0, після чого парні ріди об'єднували без перекриття та сортували за послідовностями праймерів на чотири файли у форматі fasta відповідно до секвенованих зразків. Всі отримані послідовності дереплікували за допомогою програми vsearch з автоматичним підрахунком їх частоти (--derep_fulllength, --sizeout). Варіанти з частотою менше 3 копій відфільтровували для виключення можливих помилок секвенування. Далі всі послідовності картували на отриману базу гаплотипів з використанням vsearch (--usearch_global, --id 0.97) для визначення їх приналежності. Відсоткове співвідношення варіантів у кожному зразку розраховували як частку рідів, що відповідають певному варіанту, від загальної кількості успішно картованих рідів. В результаті для обох зразків R. japonica був виявлений єдиний варіант послідовності другого інтрона LEAFY, тоді як в геномах двох зразків R. R bohemica виявлено по три однакові варіанти у співвідношеннях 50 %:29 %:21 % та 46 %:28 %: 26 %. Джерела інформації: 1. Desjardins, S. D., Bailey, J. P., Zhang, В., Zhao, К., & Schwarzacher, Т. (2023). New insights into the phylogenetic relationships of Japanese knotweed {Reynoutria japonica) and allied taxa in subtribe Reynoutriinae (Polygonaceae). PhytoKeys, 220, 83. 2. Luque, G. M., Bellard, C, Bertelsmeier, C, Bonnaud, E., Genovesi, P., Simberloff, D., & Courchamp, F. (2014). The 100th of the world's worst invasive alien species. Biol. Invasions, 76(5), 981-985. 3. Reynoutria sachalinensis (F. Schmidt) Nakai in GBIF Secretariat. GBIF Backbone Taxonomy. 2023. Checklist dataset accessed via GBIF.org on 2025-11-18. 4. Schuster, T. M., Wilson, K. L., & Kron, K. A. (2011). Phylogenetic relationships of Muehlenbeckia, Fallopia, and Reynoutria (Polygonaceae) investigated with chloroplast and nuclear sequence data. Int. J. Plant Sci., 772(8), 1053-1066. 5. Tippery, N. P., Olson, A. L., & Wendtlandt, J. L. (2021). Using the nuclear LEAFYgene to reconstruct phylogenetic relationships among invasive knotweed (Reynoutria, Polygonaceae) populations. Invasive Plant Sci. Manag., 14(2), 92-100. 6. Tippery, N. P., Sabol, M. M, Koehler, J. G., Topol, C. E., & Crossgrove, K. (2025). Assessing the genetic composition of invasive knotweeds (Reynoutria, Polygonaceae) using data from the first intron and second exon of the nuclear LEAFY gene. Invasive Plant Sci. Manag, 18, el. 7. Zheng, X., Ни, С, Spooner, D., Liu, J., Cao, J., & Teng, Y. (2011). Molecular evolution of Adh and LEAFY and the phylogenetic utility of their introns in Pyrus (Rosaceae). BMCEvol. Biol, 77(1), 255. 8. Панчук, I. I., & Волков, Р. A. (2007). Практикум з молекулярної генетики. Чернівці: Рута, 120.