СПОСІБ ПІДВИЩЕННЯ ВРОЖАЙНОСТІ СОЇ ЗА ВИКОРИСТАННЯ ШТАМУ BRADYRHIZOBIUM DIAZOEFFICIENS IMB B-8108 - ПРОДУЦЕНТА ФІТОГОРМОНАЛЬНИХ РЕЧОВИН

Спосіб підвищення врожайності сої, який відрізняється тим, що перед посівом насіння інокулюють високоефективним і конкурентоспроможним штамом бульбочкових бактерій Bradyrhizobium diazoefficiens IMB В-8108 - продуцентом фітогормональних речовин, із розрахунку 200-300 тис. клітин на 1 насінину, депонованим у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером В-8108.

Корисна модель належить до галузі сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробних засобів підвищення врожайності сої шляхом використання штаму бульбочкових бактерій виду Bradyrhizobium diazoefficiens - продуцента речовин фітогормональної природи. Соя (Glycine max (L.) Merr.) є основною зернобобовою культурою світового землеробства і однією із стратегічних культур для України. Використання активних штамів бульбочкових бактерій для покращення росту та живлення рослин сої вважається перспективним підходом в екологічному землеробстві. Як основа біологічних препаратів вони забезпечують підвищення врожайності, поліпшення якості одержуваної продукції та сприяють формуванню в агроценозах місцевих угруповань специфічних бульбочкових бактерій [1-2]. Відомо, що у симбіотичні взаємовідносини з соєю можуть вступати бульбочкові бактерії різних видів: Bradyrhizobium japonicum, В. elkanii, В. diazoefficiens, В. liaoningense, В. yuanmingense, Ensifer (Sinorhizobium) tredii, S. xinjiangensis і Mesorhizobium tianshanense [3]. У ґрунтах України типовими мікросимбіонтами сої є бульбочкові бактерії виду В. japonicum. У вітчизняній літературі не виявлено даних щодо інфікування сої іншими видами ризобій. Важливим завданням сьогодення залишається збільшення продуктивності цієї культури. Використання штамів-інокулянтів ризобій сої нових для України видів може забезпечити не лише розвиток активного симбіозу, підвищення урожайності сої, але і сприятиме формуванню гетерогенних ґрунтових популяцій її мікросимбіонтів, підтримці їх біологічного різноманіття. Відомі штами бульбочкових бактерій В. japonicum 24108 [4] і В. japonicum КН10, які рекомендовані для підвищення урожайності сої [5]. Відомий штам В. japonicum 6346, який широко застосовується як стандартний штам у наукових дослідженнях і є активним симбіотичним азотфіксатором. Найбільш близьким до запропонованої корисної моделі є штам В.japonicum M-8 біоагент мікробних препаратів для сої [6]. Проте зазначені штами бульбочкових бактерій виду В. japonicum поступаються пропонованому штаму виду В. diazoefficiens за конкурентоспроможністю та здатністю підвищувати урожайність сої. Також практично не досліджувалась їх здатність продукувати біологічно активні речовини фітогормональної природи, яка є одним із важливих критеріїв симбіотичного потенціалу ризобій. В основу корисної моделі поставлена задача підвищити урожайність сої шляхом передпосівної обробки насіння новим високоефективним і конкурентоспроможним штамом бульбочкових бактерій виду Bradyrhizobium diazoefficiens, який, на відміну від аналогів, здатний продукувати фітогормони-стимулятори, що приймають активну участь у процесах колонізації кореня та формування бульбочок, функціонуванні симбіотичних систем, стимуляції росту та розвитку рослин. Для вирішення поставленої задачі насіння сої перед посівом інокулюють штамом бульбочкових бактерій нового для України виду В. diazoefficiens IMB В-8108, отриманим методом аналітичної селекції. Інокуляційне навантаження становить -200-300 тис. клітин на І насінину. Запропонований штам характеризується комплексом господарсько-цінних властивостей: він здатний синтезувати фітогормональні речовини ауксинової, цитокінінової та гіберелінової природи, активізувати розвиток симбіозу сої на фоні численних ґрунтових популяцій специфічних ризобій, забезпечити стабільно високі врожаї зерна цієї культури. Новий штам В. diazoefficiens IMB В-8108 виділений з бульбочок вігни китайської (Vigna unguiculata (L.) Walp., яку вирощували на дерново-підзолистому ґрунті як бобову "рослину-пастку" (дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів). рН водне ґрунту 6,0; вміст гумусу 1,2 %; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) - 57,0-58,0 мг; Р2О5 160,0-165,0 мг і K2О (за Кірсановим) - 100,0-1 12,0 мг на 1 кг ґрунту. Запропонований для інокуляції сої новий штам ідентифікований за визначником Берджі [7] та на основі молекулярно-генетичних досліджень як Bradyrhizobium diazoefficiens і депонований у Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України (м. Київ) під номером В-8108. Він також зберігається в Колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН під реєстраційним номером 289. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам В. diazoefficiens IMB В-8108 добре росте за температури 26-28 °C на модифікованому живильному бобовому середовищі такого складу, г/л: К2НРО4 - 0,5, КН2РО4 - 0,5, MgSO4 - 0,2, NaCl - 0,2, CaSO4 - 0,1, (ΝΗ4)2ΜοΟ4 - сліди, маніт - 20,0, агар-агар - 14,0, люпиновий відвар - 150 мл, рН=6,5-7,0, стерилізація -1 атм. 30 хв. Культура бактерій повільноросла, неспороносна. Клітини рухливі, мають форму злегка зігнутих паличок, грамнегативні. Штрих на бобовому середовищі (із люпиновим відваром) слизистий, білуватий, опуклий. На 9-10 добу росту на чашках Петрі колонії округлої форми, непрозорі, білуваті, діаметр їх не перебільшує 1 мм. Оптимальна температура росту - 28 °C, рН=6,5-7,0. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, підвищує рН середовища до лужного. Желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам добре росте на середовищах з глюкозою, галактозою, арабінозою, манітом та сорбітом, помірно використовує рамнозу, мальтозу і сахарозу, слабо - ксилозу. Не засвоює дульцит, та рафінозу. Відношення до джерел азоту. Запропонований штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм, гліцином та тирозином. Переважно використовує відновлені форми азоту. На м'яcо-пептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз у 6 місяців і зберігається в лабораторних умовах на твердому бобовому (люпиновому) середовищі при 4-5 °C. Генетичні особливості штаму. Штам В. diazoefficiens IMB В-8108 філогенетично наближений до штамів групи USDA 110 (В. diazoefficiens USDA 110) (гомологія 99,3 % по міжгенному регіону 16S-23S рРНК). При ампліфікації ділянки міжгенного спейсера 16S-23S рРНК нового штаму утворюється фрагмент розміром ~1000 пар нуклеотидів (п.н.). При обробці цього фрагменту ферментом ендонуклеазою рестрикції Mspl генерується 5 фрагментів розміром 310, 220, 160, 140 та 1 10 п.н. Штам В. diazoefficiens IMB В-8108 характеризується здатністю продукувати позаклітинні фітогормони, підвищувати рівень фіксації молекулярного азоту та врожайність сої. Синтез фітогормональних речовин та приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. При вивченні здатності штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 до продукування фітогормональних речовин його культивували в колбах об'ємом 750 мл на качалці (220 об/хв) за температури 26-28 °C на рідкому поживному манітно-дріжджовому середовищі наступного складу (г/л): маніт - 10,0; дріжджовий екстракт - 2,0; кальцію глюконат - 1,5; К2НРО4 - 0,5; MgSO4.7H2О - 0,2; NaCl - 0,1; FeCl3-6Н2О - 0,01; рН 7,2. Як посівний матеріал використовували культуру В. diazoefficiens у експоненційній фазі росту (92-96 год.), вирощену на цьому ж середовищі. Кількість посівного матеріалу становила 5 % об'єму середовища. Для відділення біомаси культуральну рідину бактерій центрифугували впродовж 20 хв при 9000 об/хв і температурі +4 °C. Клітини бактерій відмивали від залишків екзополімерів фізіологічним розчином тричі, кожний раз центрифугували за тих же умов. Надосадову рідину використовували для подальших досліджень з метою екстракції фітогормональних сполук, а осад клітин суспендували в дистильованій воді, потім висушували при 103-105 °C у сушильній шафі до постійної маси. Кількість абсолютно сухої біомаси (АСБ) штаму визначали ваговим методом. Позаклітинні фітогормони виділяли із супернатанту бульбочкових бактерій методом, описаним у [8]. Визначення кількісного вмісту фітогормонів у культуральній рідині проводили методом високоефективної рідинної хроматографії (HPLC) на рідинному хромагографі Agilent 1200 LC (США) із діодно-матричним детектором Agilent G 1956 В. Стандартами були синтетичні фітогормони Sigma-Aldrich (Німеччина) і Acros Organic (Бельгія): ауксини індоліл-3-оцтова кислота, індол-3-масляна кислота, індол-3-карбоксилова кислота, індол-3-карбінол, індол-3-оцтової кислоти гідразид, індол-3-карбоксальдегід; цитокініни - зеатин, зеатин-рибозид, кінетин, ізопентеніл-аденін, ізопентеніл-аденозин рибозильований; абсцизова кислота; гібереліни – ГК3, ГК4. Хроматограми обраховували за допомогою програмного забезпечення ChemStation. Кількість позаклітинних фітогормонів розраховували в мкг на 1 г абсолютно сухої біомаси (АСБ) продуцента. HPLC аналіз показав, що за культивування у манітно-дріжджовому середовищі штам В. diazoefficiens IMB В-8108 синтезував фітогормональні речовини ауксинової, цитокінінової та гіберелінової природи (табл. 1). У культуральній рідині штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 ідентифіковані такі індольні сполуки як індол-3-оцтова кислота (ІОК - фізіологічно активний для рослин ауксин) (1,6 мкг/г АСБ), індол-3-карбоксальдегід (5,4 мкг/г АСБ), індол-3-карбоксилова кислота (6,3 мкг/г АСБ) та індол-3-оцтової кислоти гідразид (10,0 мкг/г АСБ). У супернатанті штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 виявлено чотири фітогормони цитокінінової природи: кінетин (1,6 мкг/г АСБ), зеатин (0,6 мкг/г АСБ), ізопентеніл-аденін (0,7 мкг/г АСБ) і ізопентеніл-аденозин (2,0 мкг/г АСБ). Таблиця 1Продукування позаклітинних фітогормонів штамом В. diazoefficiens IMB В-8108ФітогормониКількість фітогормонів, мкг/г абсолютно сухої біомасиАуксини, у тому числі:23,3Індоліл-3-оцтова кислота1,6Iндол-3-карбінол-Індол-3-масляна кислота-Індол-3-оцтової кислоти гідразид10,0Індол-3-карбоксальдегід5,4Індол-3-карбоксилова кислота6,3Цитокініни, у тому числі:4,9Кінетин1,6Зеатин0,6Зеатин-рибозид-Ізопентеніл-аденін0,7Ізопентеніл-аденозин2,0Гібереліни, у тому числі:495,1ГК3490,2ГК44,9Абсцизова кислота-Примітка. «-» фітогормони не виявлено. Варто зазначити, що пропонований штам продукував значну кількість біологічно активних гіберелінів, які відіграють важливу роль у формуванні та функціонуванні симбіозу. У культуральній рідині штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 ідентифіковані гіберелові кислоти ГК3 і ГК4 (490,2 мкг/г АСБ та 4,9 мкг/г АСБ, відповідно). Досліджуваний штам не синтезував абсцизової кислоти, яка є фітогормоном-інгібітором. Отже, пропонований штам нового для України виду В. diazoefficiens IMB В-8108, на відміну від відомих штамів В. japonicum 24108 [4], В. japonicum KH10 [5], B.japonicum 6346 і B.japonicum M-8 [6], є продуцентом широкого спектра фітогормонів-стимуляторів: ауксинів (23,3 мкг/г АСБ), цитокінінів (4,9 мкг/г АСБ) та гіберелінів (495,1 мкг/г АСБ), які впливають на процеси формування та функціонування симбіотичних систем, ріст і розвиток рослин, їх продуктивність. Приклад 2. Конкурентоспроможність штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 та вплив інокуляції сої цим штамом на симбіотичні показники і продуктивність рослин вивчали у польових дрібноділянкових дослідах у ґрунтово-кліматичних умовах Полісся України (дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН, м. Чернігів). Тип ґрунту-дерново-підзолистий. У ґрунті наявна численна місцева популяція специфічних бульбочкових бактерій. Перед посівом насіння обробляли культуральною рідиною досліджуваного штаму. Інокуляційне навантаження становило 200-300 тис. клітин на 1 насінину. У контрольному варіанті насіння обробляли водогінною водою. Вирощували сою сорту Титан (насіння надано Інститутом кормів та сільського господарства Поділля НААН). Повторність досліду чотирикратна. Площа облікової ділянки 6 м2. Розміщення ділянок рандомізоване. Встановлено, що незважаючи на значне спонтанне інфікування коренів сої у контрольному варіанті (23-96 бульбочок/рослину, залежно від фази розвитку), починаючи із фази стеблування і протягом усієї вегетації, пропонований штам В. diazoefficiens IMB В-8108 утворював більше бульбочок, що може свідчити про його високу конкурентоспроможність (табл. 2). У фази цвітіння та наливу бобів обробка насіння сої новим штамом сприяла достовірному збільшенню кількості бульбочок проти контролю на 10,4-29,8 % (залежно від фази розвитку). Важливим показником активності симбіотичної взаємодії бобової рослини з бульбочковими бактеріями є маса кореневих бульбочок. Як свідчать отримані дані, від фази стеблування до фази наливу бобів штам В. diazoefficiens IMB В-8108 забезпечив збільшення маси бульбочок на 17,1-32,1 %. Таблиця 2Вплив інокуляції новим штамом В. diazoefficiens IMB В-8108 на симбіотичні показники сої сорту Титан (польовий дослід, 2024 р.)Варіанти дослідуКількість бульбочок, од./рослинуМаса бульбочок, г/рослинуФази росту123123Без інокуляції (контроль)23,33±1,3084,17±6,9195,50±4,090,22±0,010,81±0,041,29±0,02Інокуляція В. diazoefficiens IMB В-8108 (що заявляється)25,75±2,25109,25±5,12119,25±3,590,27±0,011,07±0,051,51±0,02Примітки: 1 - фаза стеблування, 2 - фаза цвітіння, 3 - фаза наливу бобів. На фіг. 1 - Активність симбіотичної азотфіксації сої сорту Титан за інокуляції штамом В. diazoefficiens IMB B-8108 (польовий дослід, 2024 р.). HIPosу фазі: стеблування (2,05), цвітіння (4,08), наливу бобів (2,82). На фіг. 2. Частка штамів у бульбочках сої за інокуляції штамом В. diazoefficiens IMB В-8108 (польовий дослід, 2024 р., Н - індекс різноманіття Шеннона). Нітрогеназна активність бульбочок, утворених представниками ґрунтової популяції брадіризобій, була достатньо високою (14,69-24,25 мкг Ν на рослину за годину) протягом вегетації рослин (фіг. 1). Попри це, штам В. diazoefficiens IMB В-8108 сприяв формуванню найактивніших симбіотичних систем, достовірно збільшуючи цей показник проти контролю на 38,4-7,1 % (залежно від фази розвитку). Слід зазначити, що ефективність штамів бульбочкових бактерій потенційних біоагентів мікробних препаратів, значною мірою залежить від їх конкурентоспроможності та здатності займати свою екологічну нішу. Серологічний аналіз кореневих бульбочок у контрольному варіанті (фіг. 2) показав, що до складу ґрунтової популяції ризобій сої входять бактерії двох видів: B.japonicum (серогрупи HR (42 % бульбочок), 46 (17 %) і KB11 (12 %)) і В. ottawaense (серогрупа КС23 (8 % бульбочок)). У 13 % бульбочок ідентифіковані ризобії одразу двох серогруп - КВ11 і HR (вид В. japonicum). Частка в бульбочках сої бактерій, які не віднесені до відомих серогруп (інші), становила 8 %. Новий штам-інокулянт В. diazoefficiens IMB В-8108 (серогрупа В11) виявився конкурентоспроможним, він приживався у кореневій зоні рослин на фоні численної гетерогенної популяції специфічних бактерій, утворюючи 21 % бульбочок. Його проникнення у корені супроводжувалось істотним зменшенням частки у бульбочках місцевих бактерій В. japonicum серогрупи HR (з 42 % до 17 %), бактерій не віднесених до відомих серогруп (група "інші") (з 8 % до 4 %), а також зменшувалась кількість бульбочок, утворених двома штамами В. japonicum КВ11+HR (з 13 % до 4 %). Разом із тим, відмічено збільшення у бульбочках частки представників серогрупи 46 (з 17 % до 21 %) і КВ11 (з 12 % до 25 %). Загалом, інокуляція сої штамом В. diazoefficiens IMB В-8108 сприяла формуванню збалансованих симбіотичних систем, в яких не спостерігалося різкого домінування окремих штамів. Про це свідчить підвищення значення індексу різноманіття Шеннона з 1,60 у контрольному варіанті до 1,77 - у варіанті з інокуляцією. Аналіз урожайних даних сої за два роки показав, що штам-інокулянт В. diazoefficiens IMB В-8108 позитивно впливав на насіннєву продуктивність сої (табл. 3). На фоні численних популяцій брадіризобій він сприяв збільшенню урожайності сої сорту Титан на 17,5-19,6 % (залежно від року досліджень) порівняно з контролем. Таблиця 3Урожайність сої сорту Титан за інокуляції штамом В. diazoefficiens IMB В-8108 (польові досліди, 2023-2024 pp.)Варіанти дослідуУрожайність, т/гаПриріст до контролю, %20232024середнє за два рокиБез інокуляції (контроль)4,163,623,89-Інокуляція В. diazoefficiens IMB В-8108 (що заявляється)4,894,334,6118,5НІР050,380,37 Таким чином, за результатами польових дослідів новий конкурентоспроможний штам В. diazoefficiens IMB В-8108 забезпечив формування активних симбіотичних систем та сприяв стабільному збільшенню врожайності сої сорту Титан на 18,5 % (у середньому за два роки). Приклад 3. Ефективність інокуляції сої мікробним препаратом Ризогуміном на основі штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 перевіряли у виробничому досліді в ґрунтово-кліматичних умовах центрального Лісостепу України (дослідне поле Інституту кормів та сільського господарства Поділля НААН, м. Вінниця). Тип ґрунту - сірий лісовий. У ґрунті наявна численна місцева популяція ризобій сої. Перед посівом насіння обробляли біопрепаратом у розрахунку 2 кг на 1 τ насіння (інокуляційне навантаження - 200-300 тис. клітин на 1 насінину). Виробничий дослід проводили у 2024 p., використовували сою сортів Кобуко та Титан. Так, інокуляція насіння сої сорту Кобуко Ризогуміном на основі нового штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 забезпечила формування врожайності на рівні 3,45 т/га, що на 0,30 т/га (9,5 %) більше, ніж у контролі без обробки (табл. 4). За використання Ризогуміну на сої сорту Титан відмічено дещо більший приріст урожайності зерна - 0,34 т/га або 10,5 %. Таблиця 4Вплив Ризогуміну на основі штаму В. diazoefficiens IMB В-8108 на урожайність зерна сої різних сортів (виробничі умови (60 га), ІКСГП НААН)Сорт соїУрожайність, т/гаПриріст до контролю,Без інокуляції (контроль)Ризогумінт/га%Кобуко3,153,450,309,5Титан3,223,560,3410,5 Отже, для отримання стабільно високих врожаїв сої різних сортів запропоновано використовувати для передпосівної інокуляції насіння високоефективний і конкурентоспроможний штам бульбочкових бактерій В. diazoefficiens IMB В-8108. Штам с продуцентом широкого спектра фітогормонів-стимуляторів: ауксинів, цитокінінів та гіберелінів, які активно впливають на процеси ініціації бульбочкоутворення та функціонування симбіотичних систем, ріст і розвиток рослин, їх продуктивність. Джерела інформації: 1. Біологічний азот / [Патика В. П., Коць С Я., Волкогон В.В. та ін.]; за ред. В.П. Патики - К.: Світ, 2003. - 424 с. 2. Бабич А.О. Сучаене виробництво і використання сої. - К.: Урожай, 1993. - 432 с. 3. Wang E.T., Tian C.F., Chen W.F., Young J.P.W., Chen W.X. Ecology and Evolution of Rhizobia: Principles and Applications. Singapore: Springer Verlag; 2019. 4. Пат. 3324 С1 Україна, С05F 11/08, С12Ν 1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання добрив під сою / Скочинська Н.М., Антипчук А.Ф., Рангелова В.М., Канцелярук P.M., Ганцюренко О.В., Заявл. 31.07.90; Опубл. 27.12.94., Бюл.№ 1-6. - 3 с. 5. Пат. 69993 А Україна, МКИ С05F 11/08, С12N 1/20. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum для одержання бактеріального добрива під сою / Крутило Д.В., Ковалевська Т.М., Заявл. 22.12.03; Опубл. 15.09.04, Бюл. № 9. - 3 с. 6. Пат. 39545 А Україна, МКИ С05F 11/08, С12Ν 1/20. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 Kircyner, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої / Толкачов М.З., Патика В.П., Каменева І.О… Грітчіна Л.Ю., Заявл. 06.10.2000; Опубл. 16.06.01, Бюл. № 5. - 5 с. 7. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. The Proteobacteria. Part A+В+С. 2nd ed. / Eds. D.J. Brenner, N.R. Krieg, J.T. Staley. Editor-in-chief G.M. Garrity. NewYork, 2005. - 2800 p. 8. Методические рекомендации по определению фитогормонов. - К.: Ин-т ботаники АН УССР, 1988. - 78 с.