СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ПОХІДНИХ N-(АРИЛ АБО АРАЛКІЛ)-ПІРОЛ-2,5-ДІОНУ, ЯКІ ПРОЯВЛЯЮТЬ ПРОТИГРИБКОВІ ВЛАСТИВОСТІ ЩОДО CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TA CANDIDA ALBICANS

Спосіб одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону, які проявляють протигрибкові властивості щодо Cryptococcus neoformans та Candida albicans: , де R=-NO2, СН3, OCF3, СООСН3, СООСН2СН2СН3, -ОСН2О-, N-морфоліно; n=0, 1, при якому кип'ятять еквімолярні кількості фуран-2,5-діону та відповідного аміну в розчині оцтової кислоти 8 год, реакційну суміш охолоджують, додають водний розчин бікарбонату натрію, осад, що утворився, відфільтровують, сушать.

Корисна модель належить до фармацевтичної хімії та медицини, а саме до способу одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону, що проявляють протигрибкові властивості щодо Crypiococcus neoformans та Candida albicans , де R=-NO2, СН3, OCF3, СООСН3, СООСН2СН2СН3, -ОСН2О-, N-морфоліно; n=0, 1 і можуть бути використані як фармацевтичні агенти для лікування мікозів, викликаних цими патогенами. Найпоширенішим препаратом, що застосовується для терапії захворювань, викликаних Crypiococcus neoformans та Candida albicans на сьогоднішній день є амфотерицин В [1]. Цей препарат являє собою полієновий протигрибковий засіб, який використовується для лікування важких грибкових інфекцій. До інших сполук, які застосовуються в боротьбі з Crypiococcus neoformans та Candida albicans належать тріазоли [2-3], ехінокандини [4] та похідні піримідинів, такі як флуцитозин [1]. Однак, оскільки проблема резистентності до антигрибкових препаратів набуває все більшої актуальності, розробка нових нетоксичних препаратів, що мають протигрибкові властивості є надзвичайно актуальною [5-6]. На сьогодні невідомі способи одержання біологічно активних сполук з протигрибковою активністю щодо Crypiococcus neoformans та Candida albicans серед похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону [7]. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб одержання нових біологічно активних похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону, які б мали протигрибкову активність щодо Crypiococcus neoformans та Candida albicans. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону, які проявляють протигрибкові властивості щодо Cryplococcus neoformans та Candida albicans: , де R=-NO2, СН3, OCF3, СООСН3, СООСН2СН2СН3, -ОСН2О-, N-морфоліно; n=0, 1 у якому кип'ятять еквімолярні кількості фуран-2,5-діону та відповідного ароматичного аміну в розчині оцтової кислоти 8 годин, реакційну суміш охолоджують, додають водний розчин бікарбонату натрію, осад, що утворився, відфільтровують, сушать. Як нові біологічно активні сполуки запропоновано N-(2-нітро-4-метилфеніл)пірол-2,5-діон, N-(4-морфолінофеніл)пірол-2,5-діон, 4-трифторо-метоксифеніл)пірол-2,5-діон, N-(2-карбометоксифеніл)-пірол-2,5-діон, N-(4-карбометоксибензил)пірол-2,5-діон, N-(4-карбопропоксибензил)пірол-2,5-діон та N-(3,4-метилендіоксибензил)пірол-2,5-діон, ефективність яких підтверджено експериментально. В табл. 1 наведено дані антигрибкової активності заявлених сполук відносно до найбільш активних фунгіцидів проти грибкових штамів Cryplococcus neoformans та Candida albicans: амфотерицину В, флуконазолу, кетаконазолу та каспофунгіну, які були проведені за Програмою антимікробного скринінгу (The Community for Open Antimicrobial Drug Discovery, CO-ADD) та в Інституті молекулярної біонауки Університету Квінсленда, Австралія (Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland, Brisbane, Queensland 4072, Australia). Ефективність зазначених сполук виражали показником МІК, який визначали в дослідах in vitro при дії сполук, що заявляються. Проведені дослідження виявили високу активність заявлених сполук до Candida albicans та Cryptococcus neoformans (результати наведені в табл. 1). Відповідно до табл. 1, сполука 3, що одержана у способі, що запропонований перевищує ефективність за показником МІК щодо Candida albicans та Cryplococcus neoformans порівняно з Амфотерицином B y 1,5 та 3 рази, відповідно, а порівняно з Флуконазолом - у 1,25 та 16 разів щодо, відповідно, Candida albicans та Cryptococcus neoformans, а порівняно з Кетоконазолом - у 1,25 та 4 рази щодо, відповідно, Candida albicans та Cryptococcus neoformans. Таблиця 1Мінімальна інгібувальна концентрація (мкг/мл) похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону 1-7 відносно до Candida albicans та Cryptococcus neoformans та препаратів порівняння№Шифр сполукиМІК щодо С. albicans (мкг/мл)МІК щодо С. neoformans (мкг/мл)11322223243310,54448554<=0,2566817740,58Амфотерицин В1,561,569Флуконазол-81011КетоконазолКаспофунгін--28 Відповідно до табл. 1, сполука 5, перевищує ефективність за показником МІК щодо Cryptococcus neoformans порівняно з Амфотерицином В у 6,3 рази, а порівняно з Флуконазолом та Каспофунгіном - у 32 рази, а порівняно з Кетоконазолом - у 8 разів. Відповідно до табл. 1, сполука 6, перевищує ефективність за показником МІК щодо Cryptococcus neoformans порівняно з Амфотерицином В у 1,5 рази, а порівняно з Флуконазолом та Каспофунгіном - у 8 разів, а порівняно з Кетоконазолом - у 2 рази. Відповідно до табл. 1, сполука 7, перевищує ефективність за показником МІК щодо Cryptococcus neoformans порівняно з Амфотерицином В у 3 рази, а порівняно з Флуконазолом та Каспофунгіном - у 16 разів, а порівняно з Кетоконазолом - у 4 рази. Запропонований спосіб одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону при якому еквімолярні кількості фуран-2,5-діону та відповідного аміну кип'ятять в розчині оцтової кислоти 8 годин. Реакційну суміш охолоджують, додають водний розчин бікарбонату натрію, осад, що утворився, відфільтровують, сушать. Схема синтезу похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону: де R=-NO2, СН3, OCF3, СООСН3, СООСН2СН2СН3, -ОСН2О-, N-морфоліно; n=0, 1 Приклади конкретного виконання. Структуру синтезованих речовин встановлювали за допомогою мас-спектроскопії та спектрів 1Н-ЯМР, записаних у ДМСО-D6 на приладі "Varian Mercury VRX-400" з робочою частотою 400 МГц і внутрішнім стандартом - ТМС. Приклад 1. Синтез N-(2-нітро-4-іиетилфеніл)пірол-2,5-діону (1). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,52 г (0,01 моль) 2-нітро-4-метиланаліну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з пропанолу-2. Вихід 83 %; оранжеві кристали; Тпл. 142-143 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО) δ 8,06 (s, 1H), 7,60-768 (m, 2H), 7,22 (s, 2H). LC-MS m/z 233,2 [М]+. Приклад 2. Синтез N-(4-морфолінофеніл)пірол-2,5-діону (2). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,78 г (0,01 моль) 4-морфоліноаналіну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з пропанолу-2. Вихід 81 %; світло-коричневі кристали; Тпл. 211-212 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО) δ 7,15 (d, J=8,1 Hz, 2H), 7,13 (s, 2H), 7,02 (d, J=8,1 Hz, 2H). LC-MS m/z 259,3 [M]+. Приклад 3. Синтез N-(4-трифторометоксифеніл)пірол-2,5-діону (3). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,77 г (0,01 моль) 4-трифторметоксіаналіну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з пропанолу-2. Вихід 88 %; білі кристали; Тпл. 68-69 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО), δ 7,55 (d, J=7,6 Hz, 2Н), 7,50 (d, J=7,6 Hz, 2Н), 7,21 (s, 2Н). LC-MS m/z 258,2 [М]+. Приклад 4. Синтез метил 2-(2,5-діоксопірол-1-іл)бензоату (4). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,51 г (0,01 моль) метилового естеру антранілової кислоти. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з пропанолу-2. Вихід 74 %; білі кристали; Тпл. 111-112 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО) δ 7,78 (d, J=7,8 Hz, 1Н), 7,72-7,59 (m, 3Н), 7,22 (s, 2H), 3,42 (s, 3Н). LC-MS m/z 232,3 [М]+. Приклад 5. Синтез метил 4-[(2,5-діоксопірол-1-іл)метил]бензоату (5). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,65 г (0,01 моль) 4-карбоксиметилбензиламіну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з води. Вихід 76 %; світло-жовті кристали; Тпл. 135-136 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО), δ 7,91 (d, J=7,8 Hz, 2Н), 7,37 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7,11 (s, 2H), 4,67 (s, 2Н), 3,83 (s, 3Н). LC-MS m/z 246,2 [M]+. Приклад 6. Синтез пропіл 4-[(2,5-діоксопірол-1-іл)метил]бензоату (6). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,93 г (0,01 моль) 4-карбоксиметилбензиламіну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з води. Вихід 73 %; світло-жовті кристали; Тпл. 137-138 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО), δ 7,91 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7,37 (d, J=7,8 Hz, 2H), 7,11 (s, 2H), 4,67 (s, 2Н), 4,20 (t, J=7,2 Hz, 2H), 1,69 (q, J=7,4 Hz, 2H), 0,95 (t, J=7,2 Hz, 3H). LC-MS m/z 274,3 [M]+. Приклад 7. Синтез 1-(1,3-бензодіоксол-5-ілметил)пірол-2,5-діону (7). До розчину 0,97 г (0,01 моль) фуран-2,5-діону в 20 мл оцтової кислоти при перемішуванні додавали розчин 1,51 г (0,01 моль) 3,4-метилендіоксибензиламіну. Реакційну суміш кип'ятили з зворотнім холодильником протягом 8 годин та охолоджували до 20 °C. Додавали 150 мл 5 % водного розчину бікарбонату натрію. Осад, що випав, відфільтровували, промивали водою, сушили. Очищали кристалізацією з пропанолу-2. Вихід 77 %; світло-коричневі кристали; Тпл. 52,8-53,9 °C. 1Н ЯМР (400 MHz, ДМСО), δ 7,06 (s, 2Н), 6,84 (d, J=7,8 Hz, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,70 (d, J=7,8 Hz, 1H), 5,98 (s, 2H), 4,49 (s, 2H). LC-MS m/z 232,2 [M]+. Приклад 8. Дослідження протигрибкової активності. Сполуки розводили в ДМСО до кінцевої концентрації 32 мкг/мл. Після цього сполуки послідовно розводили, зменшуючи концентрацію вдвічі загалом до 8 разів. Тестування здійснювали у 384-лункових мікропланшетах. Кожну концентрацію сполуки тестували у двох повторах. Кінцева концентрація ДМСО в зразках не перевищувала 0,5 %. У дослідженні використовували еталонний штам CLSI Candida albicans (ATCC 90028) і штам Н99 Cryptococcus neoformans (ATCC 208821). Гриби культивували в дріжджовому екстракті пептон декстрози (YPD) протягом 3 днів при температурі 30 °C. Для створення суспензії дріжджів було відібрано п'ять колоній, їх щільність була відрегульована до діапазону від 1×106 до 5×106 КУО/мл спираючись на вимірювання оптичної густини при 530 нм (OD530). Після цього суспензію розводили і додавали в кожну лунку, що містили досліджувані сполуки. В результаті кінцева щільність суспензії клітин грибів складала 2,5×103 КУО/мл, а загальним об'єм - 50 мкл на лунку. Закриті планшети інкубували при температурі 35 °C протягом 36 годин без струшування. Для оцінки інгібування росту С. albicans, вимірювали поглинання при 630 нм (OD630), тоді як для С. neoformans вимірювали різницю в поглинанні між 600 і 570 нм (OD600-570). Вимірювання проводили після додавання резазурину в кінцевій концентрації 0,001 % та інкубації зразків при 35 °C протягом 2 годин. Щоб визначити відсоток пригнічення росту для кожної лунки, негативний контроль (лише середовище) і позитивний контроль (гриби без інгібіторів) поміщали в один планшет. Розрахунок проводили на основі порівняння із цими контролями. Мінімальна інгібувальна концентрація (МІК) була визначена як найнижча концентрація, при якій спостерігалося повне пригнічення росту. Значення МІК для відповідних сполук та стандартних речовин наведено в таблиці 1. Визначення цитотоксичності Визначення цитотоксичності (або виживання клітин) проводилось на клітинній лінії НЕК293. Для цього клітини висівали в 384-лункові плати зі сполуками. Кінцева щільність клітин в одній лунці становила 5000 клітин/лунку в об'ємі 50 мкл. Кількість клітин визначали вручну за допомогою гемоцитометра Нойбауера. Клітини вирощували в поживному середовищі ДМЕМ з 10 % ембріональної сироватки великої рогатої худоби протягом 20 год. при температурі 37 °C в термостаті з подачею СО2 (5 %). Цитотоксичність визначали за показниками флуоресценції (довжина хвилі збудження: 560/10 нм, хвилі випромінювання - 590/10 нм (F560/590)) після додавання резазурину (фінальна концентрація 2,3 мкг/мл) та після інкубації протягом 3 год. при температурі 37 °C в термостаті з подачею СО2 (5 %). Вимірювання проводили на платковому рідері Тесаn М1000 Promonochromator з використанням автоматичного розрахунку підсилення. CC50 (концентрація сполуки при 50 % цитотоксичності) розраховувалось графічно. Побудова кривої здійснювалось протоколом Pipeline Pilot's "dose-response component". Максимальний відсоток цитотоксичності визначається як DMax. Значення зі знаком > вказує на відсутність активності (низьке значення DMax) або зразки зі значеннями CC50 вище максимальної тестованої концентрації (вище значення DMax). Цитотоксичними вважали сполуки зі значенням CC50 ≤ 32 мкг/мл або СС50 ≤ 10 мкг/мл у будь-якому з повторів (n=2 на різних плашках). Крім цього, сполуки позначали як частково цитотоксичні якщо значення DМах 50 % навіть зі значенням CC50 > максимально тестованої концентрації. У результаті проведення цих досліджень виявилося, що запропоновані сполуки не проявили цитотоксичний ефект (див. Таблиця 2). Дослідження гемолізу Цільну кров людини тричі промивали трьома об'ємами 0,9 % розчину NaCl та ресуспендували для отримання концентрації 0,5×108 клітин/мл. Кількість клітин визначалась в гемоцитометрі Нойбауера. Промиті клітини додавали до 384-лункових плашок з сполуками. Кінцевий об'єм проби мав становити 50 мкл. Через 10 хв перемішування на шейкері для плашок, зразки інкубували протягом 1 год. при температурі 37 °C. Після інкубації плашки центрифугували при 1000 g 10 хв. Після цього 25 мкл супернатанту перенесли в 384-лункові полістиренові плашки. Кількісні показники гемолізу визначали шляхом вимірювання абсорбції супернатанту при λ=405 нм (OD405). Абсорбцію визначали за допомогою платкового рідера Тесаn М1000 Promonochromator. Концентрацію сполуки, що призводила до 10 % та 50 % гемолізу (НС10 та HC50) визначали графічно. Крім цього, максимальний відсоток гемолізу визначали як DMax, вказуючи на будь-які сполуки з частковим гемолізом. Побудова кривої здійснювалось протоколом Pipeline Pilot's "dose-response component". Сполуки вважали гемолітичними якщо НС10 ≤ 32 мкг/мл або НС10 ≤ 10 μМ у будь-якому з повторів (n=2 на різних плашках). Якщо значення DMax було ≥ 50 % навіть зі значенням НС10 > максимально тестованої концентрації сполуки вважали частково гемолітичними. Дані дослідження гемолізу представлені в таблиці 2. Досліджувані сполуки не призводять до гемолізу. Таблиця 2Дані дослідження гемолітичних та цитотоксичних властивостей,похідних N-(арил, та аралкіл)-пірол-2,5-діонуНомер сполукиНС10, мкг/млСС50, мкг/мл1>32>322>32>323>32>324>32>325>32>326>32>327>32>32 Приготування стандартів антибіотиків, цитотоксичних та гемолітичних агентів. Контроль якості. Як позитивний контроль інгібування росту С. neoformans використовували амфотерицин В, флуконазол, кетаконазол та каспофунгін. Як позитивний стандарт цитотоксичності застосовували тамоксифен. Мелітин був використаний як позитивний гемолітичний стандарт. Кожний стандартний антибіотик використовували в чотирьох концентраціях - дві з яких були вищі, а дві - нижче значень МІС та ІС50. Тамоксифен та мелітин використовували у 8 концентраціях з двократним серійним розведенням з найвищою концентрацією - 50 мкг/мл. Контроль якості визначали за фактором Z', розрахованого на основі негативних (лише середовище) та позитивних контролів (культура бактерій чи грибів без інгібітору) та стандартів. Плашки із величиною фактора Z' ' 0,4 та стандартів, активних при найвищих концентраціях та неактивних при найнижчих концентраціях були використані для подальшого аналізу. Таким чином, запропоновано спосіб одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону кип'ятінням еквімолярних кількостей фуран-2,5-діону та відповідного аміну в розчині оцтової кислоти 8 годин. Результатом винаходу є суттєве спрощення процесу одержання похідних N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону, значне підвищення їх доступності. Відповідно до таблиць 1, 2 одержані нові похідні N-(арил або аралкіл)-пірол-2,5-діону проявляють протигрибкову дію проти штаму Candida albicans ATCC 90028 та штаму Cryptococcus neoformans ATCC 208821 208821 на рівні відомих препаратів (амфотерицину В, флуконазолу, кетаконазолу та каспофунгіну), а деякі з цих сполук навіть перевищують їх у 1,25-16 разів; не токсичні та не шкідливі для клітин крові. Запропоновані сполуки можуть бути використані при створенні нового препарату для лікування кандидозів та криптококозів. Джерела інформації: 1. Antifungal combinations for treatment of cryptococcal meningitis in Africa / [Molloy, S. F., Kanyama, C., Heyderman, R. S., et al.]. // New Eng. J. of Med. - 2018. - Vol. 378. - P. 1004-1017. 2. Novel triazole antifungal agents / [Hoffman, H. L., Ernst, E. J., Klepser, M. E.]. // Exp. Opin. on Invest. Drugs. - 2000. - Vol. 9. - P. 593-605. 3. In vitro and in vivo efficacies of the new triazole albaconazole against Cryptococcus neoformans / [Miller, J. L., Schell, W. A., Wills, E. A. et al.]. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2004. - Vol. 48. - P. 384-387. 4. Postantifungal effects of echinocandin, azole, and polyene antifungal agents against Candida albicans and Cryptococcus neoformans I [Ernst, E. J., Klepser, M. E., Pfaller, M. A.]. // Antimicrob. Agents Chemother. - 2000. - Vol. 44. - P. 1108-1111. 5. Evolutionary emergence of drug resistance in Candida opportunistic pathogens / [Ksiezopolska, E., Gabaldon, Т.]. // Genes. - 2018. - Vol. 9. - P. 461-485. 6. A titanic drug resistance threat in Cryptococcus neoformans / [Zafar, H., Altamirano, S., Ballou, E. R., Nielsen, K.]. // Current Opin. in Microbiol. - 2019. - Vol. 52. - P. 158-164. 7. Benzannulation with Et3N as 1,3-Diene Variants / [Lipeng, L., Wenjia, W., Yuping Zh. et al.]. // Org. Lett. - 2023. - Vol. 25. - № 43. - P. 7775-7779.