СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ КОМПОЗИЦІЇ ДЛЯ ЗАГОЄННЯ РАН НА ОСНОВІ МЕТАБОЛІТІВ ПРОБІОТИЧНИХ ШТАМІВ БАКТЕРІЙ

Спосіб одержання композиції для загоєння ран на основі метаболітів пробіотичних штамів бактерій, який характеризується тим, що штами бактерій Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB B-7142 і Bacillus amyloliquefasiens ssp. plantarum ІMB B-7143 роздільно культивують на синтетичному середовищі із додаванням нано-СеО2 у концентрації 0,01 мМ, після чого культуральну рідину кожного штаму центрифугують, відфільтровують та змішують у співвідношенні 1:1.

Корисна модель належить до мікробіології, медицини та біотехнології, а саме стосується мікробних засобів для загоєння ран на основі комплексу екзометаболітів пробіотичних бактерій. Аеробні спороутворюючі бактерії роду Bacillus розглядають як перспективну групу мікроорганізмів для створення антимікробних препаратів. Особливо це актуально у зв'язку з швидким поширенням патогенних мікроорганізмів, резистентних до антибіотиків [1]. Штами бацил є компонентами пробіотичних препаратів для лікування різних патологічних станів людини та тварин, в тому числі інфекційних процесів, завдяки їх здатності до синтезу комплексу біологічно активних метаболітів (антибіотичних речовин, ферментів, антиоксидантних речовин, амінокислот, полісахаридів, вітамінів та інших) [2], [3]. Так, зокрема встановлено позитивний вплив пробіотичних бактерій роду Bacillus на процеси загоєння ран в ряді досліджень. Відомий ранозагоювальний біопрепарат, що містить живу мікробну масу штаму Bacillus subtilis 3Н або штаму Bacillus subtilis 11В, або штаму Bacillus 12В і гелеву основу [4]. Бактиспорин (В. subtilis 3Н), який спричиняє антибактеріальну дію, сприяє очищенню ран та осередків запалення від некротизованих тканин [5]. Відомий препарат Споробактерин на основі штаму Bacillus subtilis 534, рекомендований для лікування запальних процесів та ран різного генезу, профілактики гнійно-септичних ускладнень до та після хірургічних операцій [6]. Недоліком даних препаратів є їх монокомпонентний склад, що обмежує їх лікувально-профілактичну ефективність. Також у всіх випадках рани обробляють або суспензією живих клітин Bacillus subtilis, або мазями, що містять спори бацил. Перспективним підходом до лікування ран є використання постбіотиків, які є цінними функціональними біоактивними речовинами, синтезованими пробіотичними штамами мікроорганізмів у процесі їхньої метаболічної активності [7]. Актуальним напрямком досліджень є використання наноматеріалів, зокрема, часток діоксиду церію, які здатні підвищувати біологічну активність мікроорганізмів [8]. Наноцерій (нанооксид церію, СеО2) має великий потенціал у біомедичних дослідженнях завдяки своїм унікальним фізико-хімічним та біологічним властивостям. Відомо про дослідження метаболічних профілів пробіотичних штамів мікроорганізмів: родів Lactobacillus, Bifidobacterium та Bacillus за присутності наночасток СеО2 у культуральному середовищі [9]. Однак завданням зазначеного дослідження не було створення композицій штамів мікроорганізмів із цільовим призначенням. Найближчим аналогом до корисної моделі є спосіб одержання композиції пробіотичних штамів Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum з антиоксидантною активністю, що була заявлена у патенті на корисну модель № 140654 від 10.03.2020 р. Недоліком способу одержання зазначеної композиції є те, що останній не передбачав виділення метаболітів із культурального середовища для їх зовнішнього застосування для загоєння ранових поверхонь. Крім цього, важливим є збільшення ростової та метаболічної активностей штамів під впливом наноцерію. В основу корисної моделі поставлено задачу розроблення способу отримання композиції на основі метаболітів пробіотичних бактерій роду Bacillus із удосконаленням способу культивування бактерій для підвищення їх ростової та метаболічної активності, визначення оптимальних умов для отримання екзометаболітів із культурального середовища для забезпечення лікувальної, антимікробної, антиоксидантної дії композиції. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання композиції для загоєння ран на основі метаболітів пробіотичних штамів бактерій, який характеризується тим, що штами бактерій Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB B-7142 і Bacillus amyloliquefasiens ssp. plantarum ІMB B-7143 роздільно культивують на синтетичному середовищі із додаванням нано-СеО2 у концентрації 0,01 мМ, після чого культуральну рідину кожного штаму центрифугують, відфільтровують та змішують у співвідношенні 1:1. Штами культур Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum IMB B-7142 і В. amyloliquefaciens ssp. plantarum IMB B-7143 культивують окремо на синтетичному середовищі з наноцерієм (нано-СеО2). Культуральну рідину (КР) пробіотичних штамів В. amyloliquefaciens ssp. plantarum після вирощування на качалках звільняють від клітин шляхом центрифугування та фільтрування. Безклітинні культуральні середовища змішують у співвідношенні 1:1 для отримання ранозагоювальної пробіотичної композиції супернатантів штамів бацил з підвищеними антимікробною, антиоксидантною та лікувальною активностями. Застосовані для здійснення способу пробіотичні штами роду Bacillus, взаємно доповнюють один одного за спектром біологічної активності та продукують комплекс корисних метаболітів (антибіотичні та антиоксидантні сполуки, протеолітичні ферменти, полісахариди). Штами бактерій синтезують антимікробні речовини, які пригнічують широкий спектр патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів; фенольні сполуки з високою антиоксидантною активністю, що сприяють загоєнню ран та регенерації тканин; їх протеолітичні ферменти із тромболітичним ефектом попереджують утворення рубців та некротичний лізис тканин, тому прискорюють регенерацію тканин; екзополісахариди чинять антимікробний, антиоксидантний, антибіоплівковий, імуномодулюючий вплив. Штами бактерій В. amyloliquefaciens ssp. plantarum IMB В-7142 і IMB В-7143 вирощують на синтетичному середовищі наступного складу (г/л): глюкоза - 15,2, цитрат натрію - 1,29, (ΝΗ4)2ΗΡΟ4 - 4,75, KН2РО4 - 9,63, MgSO4×7H2O - 0,18, рН=6,4-7,0. Культури вирощують в колбах Ерленмейєра (V=750 мл) із 50 мл середовища в періодичних умовах на качалці (n=220 об./хв) при температурі 37 °C впродовж 24-48 год. Інокулят готують із 24-годинних бактеріальних клітин після росту на МПА по стандарту щільності 5 од. 5 % інокуляту додають до середовища культивування (2,5 мл на 50 мл поживного середовища). Використовують стабілізований цитратом водний золь СеО2 (0,1 М, 3-4 нм розмір часток, співвідношення стабілізатора до нано-СеО2 як 1:1) [10]. Концентрацію стокового золю нано-СеО2 зменшують в 10-1000 разів у стерильному фізіологічному розчині з наступним додаванням отриманих аліквот до середовища для вирощування мікроорганізмів у співвідношенні 1:100 (V : V). Кількість життєздатних клітин (КУО/мл або титр) визначають шляхом серійних десятикратних розведень у фізіологічному розчині та висівають на МПА. Нано-СеО2 додають до поживного середовища в оптимальній кінцевій концентрації 0,01 мМ. Після вирощування на качалці культуральні рідини (КР) пробіотичних штамів В. amyloliquefaciens ssp. plantarum звільняють від клітин шляхом центрифугування на центрифузі ОПн-8 - при 5000 g 15 хв. Звільнені від клітин супернатанти пропускають через шприцеві фільтри (PTFE, гідрофільні, d=13 мм, розмір пор мембрани - 0,22 мкм). Відфільтроване культуральне середовище кожного штаму об'єднують у співвідношенні 1:1. Оптимальна концентрація нано-СеО2 в поживному середовищі становила 0,01 мМ (табл. 1). Таблиця 1Ростова активність штамів бактерій Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142 та Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7143 за їх культивування з різними концентраціями нано-СеО2Варіанти дослідуЧисельність клітин, КУО/млВ. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142Β. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7143*Контроль(2,65±0,1)·108(3,29±0,3)·108+ 1 мМ нано-СеО2(9,67±0,2)·106(1,37±0,2)·107+ 0,1 мМ нано-СеО2(2,03±0,2)·108(1,76±0,1)·108+ 0,01 мМ нано-СеО2(3,52±0,1)·108(3,88±0,3)·108Примітка:початкова концентрація клітин В. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142 становила (5,1±0,5)·106 КУО/мл,початкова концентрація клітин В. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7143 становила (1,29±0,1)·106 КУО/мл;*контроль - середовище без нано-СеО2. Для підтвердження ефективності запропонованої композиції проводять дослідження антимікробної, антиоксидантної та лікувальної активностей супернатантів культур пробіотичних штамів, отриманих за їх культивування з наноцерієм у концентрації 0,01 мМ. Наведені нижче приклади призначені для ілюстрації та підтвердження ефективності запропонованої корисної моделі. Приклад 1. Антимікробна активність Культивування штамів ІMB В-7142, ІMB В-7143 на живильному середовищі з нано-СеО2 впродовж 24-48 год сприяло підвищенню продукції ними метаболітів з антимікробною активністю щодо умовно патогенних тест-культур: грамнегативних (P. vulgaris, Ε coli, P. aeruginosa), грампозитивних (S. aureus) та дріжджоподібних грибків (С. albicans) Безклітинні супернатанти штамів ІMB В-7142, ІMB В-7143, отримані після 24-вирощування бактерій з нано-СеО2, активно інгібують ріст клітин умовно-патогенних тест-культур, окрім P. aeruginosa ATCC 27959 (табл. 2). Ця активність була вищою, ніж та, що була виявлена у даних штамів без додавання нано-СеО2. Після 48 год культивування бактерій з нано-СеО2 спостерігали ще вищий рівень антимікробної активності супернатанту до всіх досліджуваних тест-культур, в тому числі до P. aeruginosa ATCC 27959, яка була відсутня у 24-годинних культур. Таблиця 2Антимікробна активність безклітинних супернатантів штамів Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142 і В. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7143 щодо умовно патогенних мікроорганізмівУмовно-патогенні штамиДіаметр зони інгібування тест-культур, ммBacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB B-7142Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB B-7143Контроль+ нано-СеО2Контроль+ нано-СеО224 годP. vulgaris 7212,7±0,914,0±1,311,7±0,615,5±0,9**Ε. coli 02815,1±1,217,5±0,6*14,1±0,916,3±0,5*S. aureus 20911,8±0,719,5±0,3**11,8±0,312,5±0,6С. albicans 69011,7±0,516,5±1,1**12,5±0,514,0±1,4P. aeruginosa ATCC 27959----4SгодP. vulgaris 7214,5±2,122,0±2,6**13,1±2,417,0±1,8E. coli 02817,0±0,523,0±0,1**12,5±0,615,0±1,1*S. aureus 20915,8±0,825,0±4,4**18,3±0,921,5±0,9*C. albicans 69013,2±0,621,0±4,1**11,6±0,719,4±0,7**P. aeruginosa ATCC 2795911,3±0,313,2±0,8*11,8±0,614,3±0,4*Примітки: "-" - зона інгібування відсутня; * - Р<0,05; ** - Р<0,01. Контроль - безклітинний супернатант, який отримували після культивування штаму бактерій в поживному середовищі без додавання нано-СеО2. До переваг композиції, що одержують за способом слід віднести її антифунгальну активність щодо патогенних дріжджових грибів С. albicans. Приклад 2. Антиоксидантна активністьВстановлено, що за культивування пробіотичних штамів В. amyloliquefaciens spp. plantarum ІMB В-7142 та ІMB В-7143 з 0.01 мМ нано-СеО2 впродовж 24 та 48 год суттєво зросла здатність їх безклітинних супернатантів деактивувати DPPH (2,2-дифеніл-1-пікрилгідразил радикал), гідроксильний радикал та радикал оксиду азоту, порівняно з контрольними зразками зображеними на фіг. 1, де представлений антиоксидантний потенціал безклітинного супернатанту пробіотичного штаму B. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІМВ В-7142 за його культивування впродовж 24 (A) і 48 (B) год. в присутності нано-CeO2 (0,01 мМ). Примітки. Варіанти: 1. Антирадикальна активність до DPPH (%); 2. Активність перехоплення супероксидного аніон-радикала (%); 3. Активність перехоплення радикала оксиду азоту (%); 4. Активність перехоплення гідроксильного радикала (%). На Фіг. 2 представлений антиоксидантний потенціал безклітинного супернатанту пробіотичного штаму B. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІМВ В-7143 за його культивування впродовж 24 (A) і 48 (B) год в присутності нано-CeO2 (0,01 мМ). Примітки. Варіанти: 1. Антирадикальна активність до DPPH (%); 2. Активність перехоплення супероксидного аніон-радикала (%); 3. Активність перехоплення радикала оксиду азоту (%); 4. Активність перехоплення гідроксильного радикала (%). Показано, що за вирощування пробіотичних штамів В. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142 та ІMB В-7143 впродовж 24 та 48 год присутності нано-СеО2 їх безклітинні супернатанти характеризувалися високою здатністю до інактивації гідроксильного радикала - більш, ніж на 80 та 90 % порівняно з контрольними зразками (фіг. 1; фіг. 2). Виявлено, що за культивування пробіотичного штаму ІMB В-7142 з нано-СеО2 активність перехоплення супероксидного аніон-радикала (О2•-) для його безклітинного супернатанта підвищилась лише за 24 год культивування і становила 54,2 %, тоді як за 48 год культивування - знизилась до 37,8 % (фіг. 1). Безклітинний супернатант штаму ІMB В-7143 характеризувався високими показниками даної антирадикальної активності незалежно від часу культивування (фіг. 2). Таким чином, спосіб, за якого культивують пробіотичні штами В. amyloliquefaciens ssp. plantarum ІMB В-7142 та ІMB В-7143 в присутності нано-СеО2 (0,01 мМ) сприяє підвищенню продукції даними бактеріями метаболітів з антимікробною та антиоксидантною активностями. Приклад 3. Лікувальна ефективність Ефективність композиції, одержаної за запропонованим способом, перевірена у модельних дослідах на кролях породи Шиншила при лікуванні гнійної рани, інфікованої суспензією штамів S. aureus В-4001 АТСС 6538А, K. pneumoniae-R у дозі 100 мкл (1×108кл/мл). Щоденно проводили спостереження до повного закриття рани на 24 добу досліду. В ці строки реєстрували стан рани і вимірювали площу рани в см2 та відсоток загоювання площі ранової поверхні (%) (табл. 3, 4). Лікування ран починали одразу, як спостерігали ознаки інфікування та нагноєння. Виявлено прискорення загоювання інфікованої рани кроля і зменшення площі ранової поверхні. Таблиця 3Площі ранових поверхонь у кроля за умов гнійної рани шкіриТермін спостереження, добаПлоща ранової поверхні за умов норми та обробки ран препаратами, см2Ушкодження шкіри без лікуванняУшкодження шкіри + супернатантУшкодження шкіри + інфікування S. aureus + K. pneumoniaeУшкодження шкіри + інфікування S. aureus + K. pneumoniae + супернатант12,272,272,272,2722,131,912,142,042,01,772,11,7851,771,541,881,5761,651,321,771,3891,321,131,650,94141,130,941,320,5160,940,51,130,39180,50,390,940,2200,280,20,50,13220,1300,39024000,130 Таблиця 4Динаміка загоювання площ ранових поверхонь у кроля за умов гнійної рани шкіриТермін спостереження, доба після початку лікуванняВідсоток загоювання площі ранової поверхні за умов норми та обробки ран препаратом пробіотичних штамів, %Ушкодження шкіри без лікуванняУшкодження шкіри + інфікування S. aureus + K. pneumoniaeУшкодження шкіри + інфікування S. aureus + K. pneumoniae + супернатант522,0317,1832,16627,3122,0341,85941,8527,3158,601450,2241,8577,971658,6050,2282,821877,9758,6091,192294,2777,971002410094,27100 Регенеративний ефект композиції враховують за швидкістю загоювання рани і утворення рубця. Рани, не інфіковані, без лікування, гоїлись протягом 24 діб, а гнійні і ліковані - протягом 18 діб (Табл. 4). Таким чином, отримані результати на моделі інфікованої гнійної рани у кролів свідчать про виражену ранозагоювальну дію композиції, спричинену її протизапальними й антимікробними властивостями. Спосіб одержання композиції забезпечив збільшення виходу клітинної біомаси, комплексу корисних екзометаболітів у процесі культивування штамів бацил, що обумовило її лікувальну дію: пригнічення розвитку патогенів у рані, покращення відновлення уражених тканин, прискорення їх загоєння, що свідчить про ефективність запропонованого способу. Джерела інформації: 1. Imperial, І., & Ibana, J. А. (2016). Addressing the antibiotic resistance problem with probiotics: reducing the risk of its double-edged sword effect. Front. Microbiol, 7, 1983. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01983 2. Elshaghabee, F. M. F., Rokana, N., Gulhane, R. D., Sharma, C., & Panwar, H. (2017). Bacillus as Potential Probiotics: Status, Concerns, and Future Perspectives. Front. Microbiol, 8, 1490. https://doi.org//10.3389/fmicb.2017.01490 3. Bahaddad, S. Α., Almalki, M. H. K., Alghamdi, Ο. Α., Sohrab, S. S., Yasir, M., Azhar, E. I., & Chouayekh, H. (2023). Bacillus Species as Direct-Fed Microbial Antibiotic Alternatives for Monogastric Production. Probiotics Antimicro. Prot, 15, 1-16. https://doi.org/10.1007/s 12602-022-09909-5 4. Лукманова Κ.Α., Зайнутдинова Φ.Η., Аюпова Г.В., Салихова Н.Х., Кузнецова Т.Н., Гиматдинов Р.И., Туйгунов М.М., Пат. RU2322996C2, Ранозаживляющий биопрепарат в виде геля, 2008. 5. Михайлова Н.А., Кузнецова Т.Н., Кунягина О.В., Пат. RU2130316C1, Лечебно-профилактический биопрепарат "бактиспорин", 1999. 6. Никитенко М.В., Никитенко В.И., Пат. RU2217154C2, Препарат споробактерин жидкий, 2003. 7. Kumar, Α., Green, K. Μ., & Rawat, M. (2024). A Comprehensive Overview of Postbiotics with a Special Focus on Discovery Techniques and Clinical Applications. Foods (Basel, Switzerland), 13(18), 2937. https://doi.org/10.3390/foodsl3182937 8. Л.П. Бабенко, Л.А. Данкевич, Η.Μ. Жолобак та інш. (2014). Вплив наночастинок діоксиду церію на різні фізіологічні групи мікроорганізмів. Наук. зап. Терноп. нац. пед. ун-ту. Сер. Біол., 60(3):45-51. 9. Kharchuk Μ., Kharkhota Μ., Vasyliuk Ο., Babenko L. (2022). Metabolism of lactobacillus, bifidobacterium and bacillus probiotic strains in the presence of CeO2 nanoparticles in the cultivation medium https://imv.org.ua/wp-content/uploads/2022/12/Kharchuk_2022.pdf 10. O. S. Ivanova, T. O. Shekunovae, V. K. Ivanov et.al. (2011). One-Stage Synthesis of Ceria Colloid Solutions for Biomedical Use. Doklady Chemistry, Vol. 437, Part 2, pp. 103-106.