СПОСIБ ОБРОБКИ ПЛОДІВ І ОВОЧІВ ДЛЯ ЇХ ЗБЕРІГАННЯ

1. Спосіб обробки плодів і овочів для їх зберігання, що включає обробку плодів і овочів засобом у вигляді композиції штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp., що містить штам Bacillus subtilis, який відрізняється тим, що композиція штамів бактерій роду Bacillus spp. додатково містить штами Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus і Bacillus megaterium, а засіб використовують у вигляді суспензії зазначених штамів у споровій формі при концентрації від 1,5×107 до 5×109 КУО/мл суспензії і масовому співвідношенні кожного з них 20,0+5,0 мас. %. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробку плодів і овочів здійснюють шляхом розпилення засобу.

Корисна модель стосується способів зберігання сільськогосподарської продукції землеробства та садівництва, зокрема - способів обробки плодів і овочів для їх зберігання з використанням в складі засобу пробіотичних бактерій роду Bacillus spp., і може бути використана в агропромисловому комплексі і торгових мережах для збільшення термінів зберігання овочів і фруктів. Ефективність використання окремих штамів бактерій роду Bacillus spp. проти збудників захворювань різних видів плодів і овочів науково доведена. Зокрема, переконливо підтверджена ефективність штаму Bacillus subtilis щодо наступних збудників захворювань: грибів Fusarium verticillioides та F. Verticillioides, що викликають фузаріоз (Cavaglieri L., Orlando J. et al., 2005) та Botrytis cinerea, збудника сірої гнилі багатьох рослин (Chen X., Li J. et al., 2012), фітопатогенних грибів (Pat. 02140138, 1999), іржавинних грибів Pucciniarecondita, збудників борошнистої роси Erysiphe graminis і фітофторозу розсади Fusarium culmorum culmorum (Pat. 02259397, 2005). Встановлено також, що штам Bacillus subtilis ефективен в боротьбі з патогенами на томатах, зокрема B. cinerea до 61 % (On A., Wong F. et al., 2015). Також доведено інгібуючий вплив обробки томатів штамом Bacillus subtilis на розвиток захворювань, що викликаються Penicillium sp. і Rhizopus stolonifer (Punja Z. K., Rodriguez G. et al., 2016). Встановлено протигрибкову активність штаму Bacillus subtilis в боротьбі проти клітинних захворювань яблук (Fan H., Ru J. et al., 2017), а також ефективність щодо біоконтролю захворювань картоплі, що викликаються Rhizoctonia solani (Khedher S.B., Kilani-Feki O. et al, 2015). Вивчено антагоністична активність штаму Bacillus subtilis щодо грибка Alternaria alternata, що викликає захворювання листя гірчиці (Sharma N., Sharma S., 2008), та по відношенню до таких фітопатогенних мікроорганізмів бобів, як Fusarium solani (Estevez de Jensen C., Percich J. A. et al., 2002). Відома також ефективність використання штаму Bacillus amyloliquefaciens проти збудників сірчаної форми на свіжих томатах (Mari M., Guizzardi M. et al., 1996). Відомий спосіб профілактики і лікування мікробіологічних захворювань черешні та її консервування після збору врожаю (міжнародна заявка № WO2022042121A1, МПК A01N 63/22, A01P 3/00, A23B 7/155, дата публікації 03.03.2022), за яким використовують засіб, що містить штам Bacillus velezensis TA-3-BV з нуклеотидною послідовністю 16s рДНК Bacillus velezensis TA-3-BV, що вказана в SEQ ID № 1. Засіб використовують для консервування черешні після збору врожаю шляхом інгібування грибкового захворювання, яке викликається Rhizopus stolonifer. Недоліком відомого способу є обмежений спектр захисної дії, обумовлений виборчої активністю штаму пробіотичних бактерій Bacillus velezensis TA-3-BV відносно грибкової цвілі, що викликається Rhizopus stolonifer. Відомий спосiб збереження свіжості при зберіганні фруктів та овочів (патент № CN113502240A, МПК A01N 63/22, A01P 3/00, A23B 7/155, дата публікації 15.10.2021), за яким використовують складений біологічний консервант у вигляді бактеріальної рідини або порошку штамів пробіотичних бактерій Bacillus subtilis і Bacillus velez, де Bacillus subtilis - це Bacillus subtilis з консерваційним номером CCTCC №: M 2021642 (Bacillus subtilis) NBL-B12005, а Bacillus velez - це Bacillus velezensis K-2000 і Bacillus subtilis, номер збереження cctcc №: m 2021642 (Bacillus subtilis) NBL-b12005.19 з номером депозиту cctcc no: m2020672. Співвідношення компонентів штамів Bacillus subtilis NBL-В12005 і Bacillus velezensis до-19 становить 1:1, виходячи з кількості життєздатних бактерій. Засіб використовують у вигляді бактеріального порошку або ферментаційного бульйону, який змішують з іншими допоміжними матеріалами. Засіб використовують для консервування фруктів, включаючи, персик і полуницю. Недоліками відомого способу є: - обмежений спектр захисної дії, обумовлений виборчої активністю штамів пробіотичних бактерій Bacillus subtilis і Bacillus velez; - досить великі витрати на використання способу, що обумовлені необхідністю обробки листя і фруктів на рослинах перед збором врожаю, а також великою витратою засобу в зв'язку з необхідністю їх обробки не менше двох разів. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу обробки плодів і овочів для їх зберігання за рахунок використання як засобу іншої композиції штамiв бактерій роду Bacillus spp. Технічний результат від реалізації поставленого завдання полягає у розширенні спектру протигрибкової і антибактеріальної дії способу, що дозволяє використовувати його для обробки широкого кола плодів і овочів при їх зберіганні при одночасному забезпеченні тривалого пролонгованого періоду дії за рахунок використання в засобі більш широкої композиції штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. Поставлена задача вирішується тим, що за способом обробки плодів і овочів для їх зберігання, що включає обробку плодів і овочів засобом, що містить діючу речовину у вигляді композиції штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp, що містить штам Bacillus subtilis, згідно з корисною моделлю композиція штамів бактерій роду Bacillus spp. додатково містить штами Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus і Bacillus megaterium, а засіб використовують у вигляді суспензії зазначених штамів у споровій формі при концентрації від 1,5×107 до 5×109 КУО/мл суспензії і масовому співвідношенні кожного з них 20,0+5,0 мас. %. При цьому доцільно, щоб обробку плодів і овочів здійснювали шляхом розпилення засобу. Сукупність істотних ознак заявленого способу обробки плодів і овочів для їх зберігання дозволяє вирішити поставлену задачу. При проведенні тестування заявленої композиції пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. несподівано було встановлено, що при об'єднанні штамів Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus і Bacillus megaterium їх загальний антибактеріальний потенціал значно вище, ніж потенціал кожного з штамів, що утворюють композицію. Синергічний ефект при використанні зазначеної композиції полягає в тому, що штами доповнюють один одного по спектру антагоністичної активності, виробленню ферментів і амінокислот. Це дозволяє суттєво розширити протигрибкову і антибактеріальну дію способу за рахунок запобігання утворенню патогенної біоплівки або руйнування змішаної біоплівки та індукування процесу деградації широкого кола мікроорганізмів, присутніх на поверхні плодів і овочів, а також на поверхні тари і обладнання в приміщеннях для їх зберігання. Заявлена в способі концентрація композиції штамів бактерій роду Bacillus spp спрямована на забезпечення оптимального ефекту при його використанні. Спосіб пояснюється на прикладі використання засобу для обробки плодів і овочів при їх зберіганні, розробленого Заявниками. Штами пробіотичної композиції Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus і Bacillus megaterium отримують шляхом культивування відповідно до способів, добре відомих в даній області, в тому числі з використанням середовища та інших методів, наприклад шляхом ферментації в зануреному стані, ферментації в твердому стані або культивування на рідкій поверхні. Ферментація призначена для отримання високих концентрацій колонієутворюючих одиниць клітин і для стимулювання споруляції. Приготування засобу здійснюють змішуванням відомим способом з використанням загальноприйнятих технологічних прийомів штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. у співвідношенні кожного з них 20,0+5,0 мас. % з очищеною водою до отримання їх концентрації від 1,5×107 до 5×109 КУО/мл суспензії. Після виготовлення засіб розфасовують в ємності або аерозольні балончики для використання в місцях перебирання плодів і овочів або місцях зберігання в торгових мережах. При використанні в промислових обсягах, наприклад, на підприємствах агропромислового комплексу, засіб розфасовують в ємності для подальшого використання в пристроях для аерозольного розпилення у приміщеннях для зберігання або для нанесення іншим способом. В обмежених обсягах засіб використовують звичайним способом шляхом його розпилення в рідкому вигляді на поверхню плодів і овочів з подальшою упаковкою в плівковий матеріал або зберіганням без упаковки. При використанні засобу на поверхні плодів або овочів утворюється вологе середовище, яке сприяє досить швидкій трансформації спор штамів бактерій роду Bacillus spp. у вегетативні форми. Дія пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. складається з взаємозв'язаних етапів: на першому, оскільки згадані бактерії є аеробами, то в процесі вегетації вони утворюють на обробленій поверхні захисну біоплівку, яка запобігає інфікуванню поверхні мікроорганізмами, на другому - в результаті ферментативної активності відбувається руйнування змішаної біоплівки i індукування процесу деградації мікроорганізмів, присутніх на обробленій поверхні, а на третьому етапі - забезпечується пролонгована антибактеріальна дія засобу. Випуск засобу у вигляді розчину, у тому рахунку в аерозольній упаковці, дозволяє наносити його безпосередньо на поверхню плодів і овочів при зберіганні, а також на поверхню пристроїв і обладнання, яке знаходиться в контакті з цими продуктами. При цьому досягається наступне: - фізична і мікробіологічна ізоляція оброблюваної поверхні; - хороша адгезія до оброблюваної поверхні; - можливість пролонгованої дії; - простота використання. Ефективність способу, який заявляється, підтверджена результатами представницьких досліджень безпеки використання зазначених штамів бактерій роду Bacillus spp. для харчових продуктів та протигрибкової і антибактеріальної активності пробіотичної композиції. Для дослідження використовували штами бактерій роду Bacillus spp. із колекції мікобактерій BCCM Bacteria Collec5on (Бельгія). Дослідження проведено кафедрою землеробства та агрохімії Полтавскої Державної аграрної Академії. Дослідження безпеки використання штамів бактерій роду Bacillus spp. передбачало ідентифікацію бактеріального середовища зазначених штамів способом секвенування 16s рДНК та оцінку їх токсигенного потенціалу шляхом аналізу вивільнення ЛДГ у клітинах Vero відповідно до рекомендацій Європейського управління з безпеки харчових продуктів (EFSA, журнал EFSA, 2014; 12(5):3665). За результатами секвенування всі штами кваліфіковані як імовірно безпечні. За результатами оцінки токсигенного потенціалу вони визнані як не цитотоксичні по відношенню до клітин Vero in vitro. Мета дослідження протигрибкової і антибактеріальної активності пробіотичної композиції зазначених штамів бактерій роду Bacillus spp. полягала в оцінці її ефективності відносно шкідливих мікроорганізмів, які є збудниками широко поширених захворювань. Результати випробувань наведені в таблиці. ТаблицяСкладний тест наОцінка активностіFusarium cubense +Phythophthora +Salmonella++Pseudomonas+Pythium+Trichoderma aggressivum+/-Trichoderma hazarium+Staphylococcus aureus ++Enterococcus faecalis++Escherichia coli+/-Pseudomonas aeruginosa++Streptococcus pyogenes++Candida albicans++Enterobacter cloacae++Примітки: ++ сильна позитивна активність, + позитивна активність, +/- слабка позитивна активність. З наведених даних видно, що заявлена композиція штамів бактерій роду Bacillus spp. проявляє сильну позитивну активність щодо більшості поширених і шкідливих захворювань, а також умовно-патогенних і патогенних, грамопозитивних і грамнегативних бактерій, що становлять небезпеку для людини. До них належать: - Salmonella - кишкові бактерії, що викликають гостре інфекційне захворювання шлунково-кишкового тракту; - Staphylococcus aureus - золотистий стафілокок, здатний виробляти стійкість до антибіотиків різних груп і антисептиків; - Enterococcus faecalis - вид ентерококів, який може бути збудником різних інфекцій, у тому числі сечовивідних шляхів, інтраабдомінальних, органів малого таза, ранових, ендокардиту; - Pseudomonas aeruginosa - синьогнійна паличка, яка входить до групи найнебезпечніших мікробів для населення розвинених країн, що викликають широке коло захворювань - від загальних інтоксикацій до великих гнійно-запальних процесів; - Streptococcus pyogenes - піогенний стрептокок-бактерія, збудник гнійно-запальних захворювань; - Candida albicans - диплоїдний грибок, збудник опортуністичних інфекцій людини, які передаються через рот і геніталії; - Enterobacter cloacae - умовно-патогенний мікроб, який може викликати інфекційні захворювання сечостатевої та респіраторної систем людини, включаючи аспіраційну пневмонію. Позитивна активність композиції штамів бактерій роду Bacillus spp. проявляє щодо наступних бактерій: - Fusarium cubense - грибковий рослинний збудник, який викликає панамську хворобу бананів; - Phythophthora - рід пошкоджуючих рослини ооміцетів (водних мохів), які викликають захворювання картоплі, сої, перцю, декоративних і лісових дерев; - Pseudomonas - великий рід грамнегативних, хемоорганотрофних паличкоподібних бактерій, найбільш клінічно значущим видом яких є Pseudomonas aeruginosa - синьогнійна паличка; - Pythium - рід мікроскопічних грибів з відділу ооміцети, які негативно впливають на рослини, викликаючи різні захворювання, включаючи пітіозну кореневу гниль; - Trichoderma hazarium - грунтовий гриб, здатний швидко колонізувати навколишнє середовище, запобігаючи розмноженню інших мікроорганізмів в тому ж середовищі існування. Слабка позитивна активність композиції штамів бактерій роду Bacillus spp. виявлена відносно двох наступних видів бактерій: - Trichoderma aggressivum - вид мікроскопічних грибів, який викликає зелену цвіль і небезпечний для вирощування грибів; - Escherichia coli - кишкова паличка, деякі штами якої можуть викликати інфекцію в травному тракті, сечовивідних шляхах та багатьох інших частинах тіла. Таким чином, отримані експериментальні результати переконливо показали, що використання в способі зазначених п'яти зазначених штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. демонструє значну протигрибкову і антибактеріальну дію, що дозволяє знищувати або попереджати розвиток великого спектру грибів і патогенних мікроорганізмів, які можуть утворюватися при зберіганні овочів і фруктів. Заявлений спосіб розширює коло відомих способів обробки плодів і овочів при зберіганні з використанням діючої речовини у вигляді заявленої композиції штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. Об'єднання в складі діючої речовини більш широкої композиції штамів пробіотичних бактерій роду Bacillus spp. в споровій формі значно розширює спектр дії засобу i підвищує ефективність його протигрибкової і антибактеріальної дії за рахунок синергічного доповнення один до одного штамів по спектру антагоністичної активності, виробленню ферментів і амінокислот при одночасному забезпеченні тривалого пролонгованого періоду дії засобу. Це дозволяє також збільшити область застосування способу для обробки широкого кола плодів і овочів при їх зберіганні.