ШТАМ БАКТЕРІЙ PSEUDARTHROBACTER SP. ІМВ В-7981 - ПРОДУЦЕНТ ЕКЗОПОЛІСАХАРИДІВ

Штам бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 - продуцент екзополісахаридів.

Винахід належить до галузі біології, а саме до промислової мікробіології і може бути використаний у біотехнології для одержування екзополісахаридів бактеріями Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981. Відома здатність бактерій Bacillus sp. BU-4, виділених з гіперсолоного середовища в Салар-де-Уюні (Болівія), продукувати екзополісахариди упродовж 48 год. при 30 °C за різних умов культивування. Найкращими субстратами для ефективного продукування екзополісахаридів є рідина, одержана внаслідок оброблення стебел лободи та ферментативні гідролізати тирси курупау (Anadenanthera colubrina). Вихід екзополісахаридів зі субстратів на основі стебел лободи та тирси A. colubrina становить 2,73 та 0,89 г/л, відповідно. У синтетичному глюкозовмісному середовищі Bacillus sp. BU-4 продукують 2,34 г/л екзополісахаридів (Chambi D., Romero-Soto L., Villca R., Orozco-Gutierrez F., Vega-Baudrit J. et al. Exopolysaccharides production by cultivating a bacterial isolate from the hypersaline environment of Salar de Uyuni (Bolivia) in pretreatment liquids of steam-exploded quinoa stalks and enzymatic hydrolysates of Curupau sawdust. Fermentation. 2021. 7. 33. doi: 10.3390/fermentation7010033). Недоліками у використанні бактерій Bacillus sp. BU-4 для одержування екзополісахаридів є їхня здатність продукувати екзополісахариди лише при температурі 30 °C і відносно невисокий вихід цільових продуктів. Відомі бактерії Gluconobacter frateurii TMW 2.767, Gluconobacter cerinus DSM 9533, Neoasaia chiangmaiensis NBRC 101099 та Kozakia baliensis DSM 14400, які здатні продукувати екзополісахариди у концентрації від 6 до 12 г/л. Найбільшу кількість екзополісахаридів вони продукують при 30 °C упродовж 48 год. у сахарозовмісному середовищі такого складу (г/л): глюконат натрію - 20; дріжджовий екстракт - 3; пептон - 2; гліцерин - 3; маніт - 10; сахароза - 80; агар - 20 на роторному шейкері зі швидкістю обертання 180 об/хв (Jakob F., Steger S., Vogel R.F. Influence of novel fructans produced by selected acetic acid bacteria on the volume and texture of wheat breads. Eur Food Res Technol. 2012. 234. 493-499. doi: 10.1007/s00217-011-1658-7). Недоліками у використанні бактерій G. frateurii TMW 2.767, G cerinus DSM 9533, N chiangmaiensis NBRC 101099 та К. baliensis DSM 14400 для одержування екзополісахаридів є висока вартість компонентів середовища для їхнього культивування, витрати на електроенергію для обертання роторного шейкера і здатність бактерій продукувати екзополісахариди лише при температурі 30 °C. Відомі бактерії Paenibacillus polymyxa SQR-21, які здатні продукувати екзополісахариди за різних умов культивування. Найбільшу кількість екзополісахаридів (3,44 г/л) бактерії продукують у середовищі з галактозою (48,5 г/л), Fe3+ (242 мкмоль) і Са2+ (441 мкмоль) при температурі 30 °C упродовж 96 год. (Raza W., Makeen К., Wang Υ., Xu Υ., Qirong S. Optimization, purification, characterization and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide produced by P. polymyxa SQR-21. Bioresource Technology. 2011. 102. 6095-6103. doi: 10.1016/j.biortech.2011.02.033). Недоліками у використанні бактерій P. polymyxa SQR-21 є їхня здатність продукувати екзополісахариди лише при температурі 30 °C і відносно невисокий вихід цільових продуктів. Найближчим за сукупністю суттєвих ознак - прототипом є бактерії Bacillus zhangzhouensis BZ 16, які продукують екзополісахариди за різних умов культивування. В. zhangzhouensis ZB 16 у середовищі, яке містить 25 г/л дріжджового екстракту при температурі 37 °C продукують 12,37 г/л екзополісахаридів, що у 6 разів перевищує вихід цільових продуктів, досягнутий без оптимізації умов (Miri M., Bergayou H., Belmouden Α., Moukrim Α., Baazizi Η. et al. Medium optimization for exopolysaccharides production by Bacillus zhangzhouensis ΒΖ 16 strain isolated from Khnifiss Lagoon. E3S Web of Conferences. 2021. 234. doi: 10.1051/e3sconf/202123400099). Недоліками у використанні бактерій В. zhangzhouensis ZB 16 для продукування екзополісахаридів є висока вартість компонентів середовища для їхнього культивування, а також здатність бактерій продукувати екзополісахариди лише при температурі 37 °C. В основу винаходу поставлено задачу одержати штам бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 - продуцента екзополісахаридів шляхом виділення його з природніх біотопів, що дасть змогу розширити коло продуцентів екзополісахаридів з одночасним здешевленням і збільшенням виходу цільового продукту. Поставлена задача вирішується шляхом виділення штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 зі зразка ґрунту, відібраного з місця гніздування Larus dominicanus (Мартина домініканського), о. Галіндез, Морська Антарктика (координати S 65.247453, W 064.249915), що здатний продукувати екзополісахариди. Фіг. 1. Мікросвітлина поверхні клітини штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 при збільшенні 1000. Фіг. 2. Мікросвітлина поверхні клітини штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 при збільшенні 4000. Технічний результат винаходу досягається шляхом виділення штаму Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 зі зразка ґрунту, відібраного з місця гніздування Larus dominicanus (Мартина домініканського), о. Галіндез, Морська Антарктика, способом прямого висіву водних суспензій зразку ґрунту на крохмально-аміачний агар і культивування за аеробних умов, багаторазового пересіву відібраних окремих колоній на крохмально-аміачний агар. Штам Pseudarthrobacter sp. IMB B-7981 зберігається у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. Заболотного НАН України від 6 грудня 2021 року (Гнатуш С.О., Перетятко Т.Б., Мороз О.М., Масловська О.Д., Комплікевич С.Я. Свідоцтво про депонування штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. 2B-K-54 у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України з наданням реєстраційного номеру IMB В-7981 від 06.12.2021). Для виділення бактерій водну витяжку зразка ґрунту, відібраного у березні 2021 року учасниками Української антарктичної експедиції, висівають на крохмально-аміачний агар, культивують за аеробних умов, здійснюють багаторазовий пересів відібраних окремих колоній на крохмально-аміачний агар. Для одержання ґрунтової витяжки 1 г ґрунту вносять у пробірки з 9 мл стерильного фізіологічного розчину і витримують упродовж 1 год. 100 мкл ґрунтової витяжки, розведеної у 104 разів, стерильно вносять на чашку Петрі з крохмально-аміачним агаром і культивують упродовж 10 діб при температурі 22±1 °C. Для отримання чистої культури бактерії окремі колонії тричі пересівають на чашки Петрі з крохмально-аміачним агаром. Чистоту культури контролюють мікроскопіюванням. Депонований штам відбирають за здатністю до гетеротрофного росту з використанням низки органічних субстратів як джерел карбону та стійкістю до впливу солей хрому, купруму, феруму, мангану, кадмію. Запропонованому штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 властиві такі морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки: Таблиця 1Морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981Морфологічні ознакиКлітини плеоморфні. Спор не утворюють. Нерухомі. Грампозитивні. На крохмально-аміачному агарі утворюють поверхневі круглі, блискучі колонії білого кольору з рівним краєм, 1-3 мм у діаметрі.Фізіолого-біохімічні ознакиКаталазопозитивні. Оксидазонегативні. Ростуть за температури 4-28 °C. Оптимальна температура для росту 20-22 °C. Оптимальне рН 6,8-7,3. Аероби. На триптон-соєвому бульйоні характер росту рівномірний, який супроводжується утворенням гідроген сульфіду. Аміаку під час росту на триптон-соєвому бульйоні не продукують. Індолу з триптофану не утворюють. Помірні галофіли, витримують до 15 % NaCl. За використання арабінози, глюкози, дульциту, інозитолу, ксилози, манітолу, маннози, рамнози, сахарози, сорбітолу кислоти і газу не утворюють. Асимілюють L-рамнозу, N-ацетилглюкозамін, D-рибозу, інозитол, D-сахарозу, D-мальтозу, ітаконову кислоту, молочну кислоту, L-аланін, калій 5-кетоглюконат, калій 2-кетоглюконат, глікоген, 3-гідроксибензойну кислоту, 4-гідроксибензойну кислоту, L-серин, D-манітол, D-глюкозу, саліцин, D-мелібіозу, L-фукозу, D-сорбітол, L-арабінозу, 3-гідроксибутират, L-пролін. Ростуть на середовищі Менкіної з лецитином. Здатні до азотфіксації та нітрифікації. Ростуть на голодному агарі (триптон-соєвий агар, розведення 1:10). Характеризується протеолітичною, амілолітичною та ліполітичною активностями за росту на триптон-соєвому бульйоні з 12,5 % желатину, крохмально-аміачному та середовищі з твіном-20, відповідноГенетичні ознакиПослідовність нуклеотидів гена 16S рРНК штаму Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 задепоновано у базі даних GenBank (OL342384). Послідовність нуклеотидів гена 16S рРНК Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 на 99,24 % ідентична до послідовності гена 16S рРНК штамів Pseudarthrobacter sulfonivorans ALL і Pseudarthrobacter psychrotolerans YJ56. Здатність штаму бактерій Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 продукувати екзополісахариди доведено наступним прикладом. Бактерії Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 попередньо вирощують на крохмально-аміачному агарі при температурі 26±2 °C упродовж 48-72 год. за аеробних умов до одержання суцільного газону на чашці Петрі. Мікробіологічною петлею бактерії переносять на чашки Петрі з цукровмісними середовищами, а саме: крохмально-аміачним середовищем такого складу (г/л): розчинний крохмаль - 10,0; (NH4)2SO4-2,0; К2НРО4-1,0; MgSO447H2O-1,0; NaCl-1,0; СаСО3-3,0; агар - 20,0; вода водопровідна - до 1 л), або середовищем Ешбі такого складу (г/л): сахароза або маніт - 20,0; К2НРО4-0,2; MgSO447H2O-0,2; NaCl-0,2; K2SO4-0,1; СаСО3-5,0; розчин мікроелементів - 1 мл; агар - 20,0; вода дистильована - до 1 л, або Менкіної такого складу (г/л): глюкоза - 10,0; (NH4)2SO4-0,5; MgSO447H2O-0,3; КСl-0,3; MnSO4-0,001; FeSO4-0,001; СаСО3-5,0; соєвий лецитин - 3,5; агар - 20,0; вода дистильована - до 1 л і культивують при температурі 6±1 та 22±1 °C упродовж 14±1 діб за аеробних умов. Після цього у пробірку об'ємом 15 мл з 2 мл води вносять бактерії, вирощені на чашці Петрі з одним із перелічених середовищ, ретельно перемішують, додають 2 мл 2 % розчину етилендіамінтетраоцтової кислоти і витримують при температурі 4 °C упродовж 3 год. Після цього суміш центрифугують при 15000 g упродовж 20 хв при температурі 4 °C (Pan X., Liu J., Zhang D., Chen X., Li L. et al. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using threedimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy//Water SA. 2010. 36 (1). 111-116. doi: 10.4314/wsa.v36i 1.50914). В одержаній надосадовій рідині спектрофотометрично визначають вміст екзополісахаридів з використанням антрону (С14Н10О) (Frolund В., Palmgren R., Keiding К., Nielsen P.H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin//Water Research. 1996. 30 (8). 1749-1758. doi: 10.1016/0043-1354(95)00323-1). Для цього до 0,8 мл надосадової рідини додають 1,6 мл розчину антрону у сульфатній кислоті (0,125 % антрону у 94,5 % H2SO4). Реакційну суміш перемішують, витримують на водяній бані при 100 °C упродовж 14 хв і охолоджують при 4 °C упродовж 5 хв. Визначають оптичну густину спектрофотометрично з використанням спектрофотометра DeNovix DS-11+ при довжині хвилі 625 нм. Для розрахунків концентрації екзополісахаридів використовують калібрувальну криву. Бактерії Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 продукують екзополісахариди за різних умов культивування (табл. 2). Температури росту бактерій, за яких вони продукують екзополісахариди, визначають експериментально. На середовищі Менкіної при 6±1 °C бактерії продукують 12,59±0,84 г/л екзополісахаридів, що у 3,56 разів більше порівняно з їх культивуванням при 22±1 °C; на крохмально-аміачному середовищі при 6±1 °C вони продукують 6,01±0,43 г/л екзополісахаридів і 3,22±0,25 г/л - при 22±1 °C. Таблиця 2Концентрація екзополісахаридів, продукованих бактеріямиPseudarthrobacter sp. IMB В-7981, за різних умов культивуванняТемператураПрототипPseudarthrobacter sp. IMB В-7981культивування, °CСередовище з дріжджовим екстрактомКрохмально-аміачне середовищеСередовище ЕшбіСередовище МенкіноїКонцентрація екзополісахаридів, г/л3712,37---22±1-3,22±0,253,49±0,263,54±0,186±1-6,01±0,435,27±0,3212,59±0,84 Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 на середовищі Ешбі продукують 5,27±0,32 г/л екзополісахаридів при 6±1 °C і 3,49±0,26 г/л - при 22±1 °C. Суттєве зростання концентрації екзополісахаридів, продукованих бактеріями Pseudarthrobacter sp. IMB B-7981, при температурі 6±1 °C може мати для них важливу кріопротекторну роль. Отримані результати вказують на те, що бактерії Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 є продуцентами екзополісахаридів. Pseudarthrobacter sp. IMB В-7981 є перспективними об'єктами для промислової мікробіології і можуть бути використані у біотехнології для одержування екзополісахаридів. Використання заявленого штаму дає змогу розширити асортимент продуцентів екзополісахаридів при збільшеному виході цільового продукту. Вище згадані технологічні процеси підтверджують досягнення передбачуваного технічного результату.