ПРОМІЖНА СПОЛУКА ДЛЯ ОДЕРЖАННЯ ТИРЗЕПАТИДУ

Проміжна сполука для одержання тирзепатиду, що включає послідовність SEQ ID NO: 1, причому ця проміжна сполука має послідовність SEQ ID NO: 17, або фармацевтично прийнятна сіль такої проміжної сполуки.

Цим винаходом надані способи та напівпродукти для одержання подвійного агоніста рецепторів GIP/GLP1 (глюкозозалежний інсулінотропний поліпептид/глюкагоноподібний пептид-1), тирзепатиду (tirzepatide), або його фармацевтично прийнятної солі. Цукровий діабет являє собою хронічне захворювання, яке характеризується гіперглікемією, що виникає внаслідок дефектів секреції інсуліну, дії інсуліну або обох. При цукровому діабеті 2 типу ("T2D") поєднані ефекти порушення секреції інсуліну та інсулінорезистентності пов'язуються з підвищеним рівнем глюкози в крові. Подвійний агоніст рецепторів GIP/GLP1, тирзепатид, описаний і заявлений у патенті США 9474780 ("Патент 780"). Тирзепатид може бути корисним в лікуванні T2D. В US9474780 загалом описані пептиди та спосіб одержання подвійного агоніста рецепторів GIP/GLP1. Існує потреба в способах та напівпродуктах, які дозволять вдосконалити технологію виробництва тирзепатиду, що має комбінацію переваг, в тому числі бажану для наданих до реалізації продуктів чистоту. Таким чином існує потреба в ефективних та екологічно чистих, не забруднюючих навколишнє середовище, способах, і в тому числі в стабільних напівпродуктах для одержання тирзепатиду з меншою кількістю етапів очищення. Покращена технологія також необхідна для надання виробничих процесів тирзепатиду, що продукують мінімальну сукупність відходів усіх видів, як для забезпечення підвищеної безпеки для навколишнього середовища, так і для підвищеної безпеки оператора. Виробництво у великих масштабах фармацевтично простого тирзепатиду має ряд складних технічних проблем, які можуть вплинути на загальний вихід та чистоту. Існує потреба в способах, як! б дозволяли уникнути використання застосування перехідних металів та/або жорстких умов реакції, які несумісні 3 синтезом пептидів. Цей винахід намагається задовольнити ці потреби, пропонуючи нові напівпродукти та способи, прийнятні для виробництва тирзепатиду (SEQ ID NO: 1) або його фармацевтично прийнятної солі. Удосконалені способи виготовлення тирзепатиду за цим винаходом надають напівпродукти та технологічні реакції, які втілюють комбінацію переваг, в тому числі ефективний шлях, що має меншу кількість етапів, одночасно підтримуючи високу якість та чистоту. Важливо, що вдосконалені способи та напівпродукти зменшують ресурсоємність та зводять до мінімального рівня сукупність відходів усіх видів. Удосконалені способи, описані в цьому описі, надають різні варіанти одержання напівпродуктів, прийнятних для виробництва тирзепатиду. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 17, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 11, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 22, або її фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 21, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 20, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 2, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 4, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 7, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 14, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID ΝΟ: 33. або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 32, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 34, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 35, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 36, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 38, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука, що має послідовність SEQ ID NO: 39, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука формули: або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом надана сполука формули: або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом наданий спосіб, за яким тирзепатид одержують із застосуванням нанофільтрації. Цим винаходом наданий спосіб одержання тирзепатиду, що включає відщеплення захисної групи сполуки або фармацевтично прийнятної солі сполуки, що має послідовність SEQ ID ΝΟ: 22. Цим винаходом наданий спосіб селективного ацилювання лізинової амінокислоти, де вказана лізинова амінокислота тa N-кінець є захищеними. Цим винаходом наданий спосіб селективного ацилювання лізинової амінокислоти в пептиді, що включає сполучення зв'язаного зі смолою пептиду-лізину-NH2 з трет-бутил-ейкозандіоїл-GIu-(О-трет-бутил)-(8-аміно-3,6-діоксаоктанова кислота)-(8-аміно-3,6-діоксаоктанова кислота)-ОН. Цим винаходом наданий спосіб одержання тирзепатиду, що включає відщеплення захисної групи сполуки, що має послідовність SEQ ID NO: 22, або її фармацевтично прийнятної солі. Цим винаходом наданий спосіб відщеплення захисної групи тирзепатиду, де розчин для відщеплення захисної групи містить дитіотреїтол, триізопропілсилан та трифтороцтову кислоту. Цим винаходом наданий спосіб селективного ацилювання лізинової амінокислоти, де зв'язаний зі смолою пептид-лізин-NH2 являє собою сполуку формули: або її фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом наданий спосіб перетворення депсіпептидного ізомеру на бажаний пептид, що включає: регулювання рН депсіпептидного ізомеру від рН приблизно 7 до Рн приблизно 10; та інкубування депсіпептидного ізомеру при при значеннях рН від 7 до 10 протягом щонайменше однієї години. Цим винаходом наданий спосіб перетворення депсіпептидного ізомеру. де pH вказаного депсіпептидного ізомеру регулюють від рН приблизно 8,5 до рН приблизно 9,5. Цим винаходом наданий спосіб перетворення депсіпептидного ізомеру, де згаданий депсіпептидний ізомер являє собою сполуку, що має послідовність SEQ ID NO: 40, або її фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом надана десульфуризація на основі радикалів, що включає контактування пептиду з радикальним ініціатором. В одному з варіантів здійснення цього винаходу десульфуризація включає контактування пептиду, придатного - для десульфуризації, з водорозчинним радикальним ініціатором. В одному з варіантів здійснення цього винаходу радикальним ініціатором є азо-ініціатор. В одному з варіантів здійснення цього винаходу радикальний ініціатор вибирають із групи, яку складають 2,2'-азобіс[2-(2-імідазолін-2-іл)пропан]дигідрохлорид (VA-044) та 2,2'-азобіс (2-метилпротонамідин)дигідрохлорид (VA-050). Спосіб десульфуризації на основі радикалів, наданий у цьому описі, є бажаним з екологічної точки зору, без перехідних металів та з умовами, сумісними із синтезом пептидів. У значенні, вживаному в цьому описі, наведені нижче скорочення мають значення, наведені в цьому описі: "SPPS" означає твердофазний синтез пептидів, "Fmoc" означає флуоренілметилоксикарбонілхлорид, "Рір" означає піперидин, "DIC" означає діізопропілкарбодіімід, "Oxyma" означає етиліціаногідроксиіміноацетат, "DCM" означає дихлорметан, "ІРА" означає ізопропанол, "МТВЕ" означає метил-трет-бутиловий простий ефір, "TFA" означає трифтороцтову кислоту, "TIPS" означає триізопропілсилан, "DTT" означає дитіотреїтол, "UPLC" означає ультра високоефективну рідинну хроматографію, "HFIP" означає гексафторізопропанол, "СТС" означає хлортритил, "НАТU" означає (1-[біс(диметиламіно)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]піридинію 3-оксидгексафторфосфат, "TFET" означає 2,2,2-трифторетантіол, "DIEA" означає N,N-діізопропілетиламін, "AEEA" означає - 17-аміно-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9-азагептадеканову кислоту, "TCEP" означає трис(2-карбоксіетил)фосфін, "DCU" означає дициклогексилсечовину, "DCC" означає дициклогексилкарбодіімід. "TMSA" означає триметилсиліамід, "HOBt" означає гідроксибензотриазол, "HRMS" означає мас-спектрометрію з високою роздільною здатністю, "LPPS" означає рідкофазовий синтез пептидів, "MSMPR" означає реактор з перемішуванням суспензії i відбором змішаного продукту, "MPA" означає рухому фазу А, "МРВ" означає рухому фазу В, "L-GSH" означає відновлений розчин L-глутатіону, "TZP" означає тирзепатид, "АР" означає активний фармацевтичний засіб, а "АРІ" означає активний фармацевтичний інгредієнт, "РyВОР" означає (бензотриазол-1-ілокси)трипіролідинофосфоній гексафторфосфат), "DEA" означає діетиламін, "TBTU" означає 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметиламінію тетрафторборат, "TNTU" означає 2-(5-норборнен-2,3-дикарбоксімідо)тетраметилуронію тетрафторборат, "PyOxim" означає 1-ціано-2-етокси-2-оксоетиліденаміноокси-трис-піролідинфосфонію гексафторфосфат, "PyClock" означає 6-хлор-бензотриазол-1-ілокси-трис-піролідинфосфонію гексафторфосфат. Як показано в цьому описі, одно літерні позначення амінокислот подані жирним шрифтом, тоді як атоми показані у вигляді нежирного тексту та загалом меншим шрифтом, щоб відрізнити їх від однолітерних позначень амінокислот. Як вжито в цьому описі, коли позначення амінокислоти з'являється з номером над амінокислотою, вказаний номер стосується відповідного положення амінокислоти в кінцевому тирзепатидному продукті. Номери надані для зручності, і поява або відсутність таких номерів у послідовності не впливає на амінокислотну послідовність або пептид, зазначений у такій послідовності. Вжитий в цьому описі термін "захищений" означає, що у зазначеному положенні приєднана захисна група. Фахівцю зрозуміло, що добре відомими є різноманітні захисні групи, і для конкретного способу можуть бути прийнятними альтернативні захисні групи. Фахівцем визнається існування альтернативних смол для побудови пептидів, описаних в цьому описі. Наприклад, фахівцю добре відомі амідні смоли Зібера та Рінка для одержання пептидів, розкритих в цьому описі; однак для одержання пептидів, описаних в цьому описі, можуть бути вибрані альтернативні смоли. Наприклад, але без обмеження, для одержання цільового пептиду можуть бути застосовані 2-СТС та споріднені смоли з подальшим етапом амідування С-кінця. Побудови твердофазного пептидного синтезу (SPPS) здійснюються із застосуванням стандартних методів Fmoc (флуоренілметилоксикарбонілхлорид)-хімії пептидів, що застосовують послідовні сполучення за допомогою автоматизованого синтезатору пептидів. Смола набухає в DMF, після чого відщеплюють її захисні групи із застосуванням 20 % розчину піперидину (Pip)/DMF (3×30 хв). Для подальшого відщеплення захисних Fmoc груп застосовують обробку 20 % розчином Pip/DMF (3×30 хв), a для більш складних сполучень використовують обробки 4×30 хв. Після відщеплення захисної групи смолу промивають (5×2 хв) 10 об'ємами DMF. Для попередньої активації амінокислот використовують розчини діізопропілкарбодііміду (DIC)/етилціаногідроксііміноацетату (Oxyma) у DMF при кімнатній температурі протягом 30 хв. Сполучення активованоі амінокислоти з пептидом, зв'язаним зі смолою, відбувається протягом визначеного часу для кожної окремої амінокислоти. Промивання розчинником 5×2 хв 10 об'ємами DMF проводять після кожного сполучення. Для виділення кінцевого продукту, зв'язаний зі смолою продукт промивають 5×2 хв 10 об'ємами DCM для видалення DMF. Смолу промивають 2×2 хв 10 об'ємами ІРА для видалення DCM, промивають 5×2 хв 10 об'ємами метил-трет-бутилового простого ефіру (МТВЕ), потім продукт сушать при температурі 40 °C під вакуумом. Зв'язаний із смолою продукт зберігають у холоді (-20 °C). Для дослідження пептид відщеплюють від смоли кислим коктейлем, який складають трифтороцтова кислота (TFA)/H2O/TIPS (триізопропілсилан)/DTT (дитіотреїтол) у такому співвідношенні: (0,93 (об'єм)/0,04 (об’єм)/0,03 (об'єм)/0,03 (маса). Смолу піддають набуханню в DCM (4-5 мл, 3×30 хв), i зливають. Коктейль для розщеплення (4-5 мл) додають до попередньо розбухлої смоли, і суспензію перемішують протягом 2 год при кімнатній температурі. Розчин фільтрують, потім смолу промивають невеликою кількістю DCM, і об'єднують з розчином для розщеплення. Одержаний розчин вливають у 7-10 об'ємів холодного (0 °C) метил-трет-бутилового простого ефіру (МТВЕ). Суспензію витримують протягом 30 хв при температурі 0 °C, потім одержаний осад центрифугують, і прозорий розчин зливають. Залишок суспендують в тому ж об'ємі МТВЕ, і одержану суспензію знову центрифугують, i декантують. Після декантації прозорий розчин МТВЕ осадженого пептиду сушать in vacuo при температурі 40 °C протягом ночі. Синтез Препарату 1 Послідовність SEQ ID NO: 2 Для синтезу застосовують Fmoc амідну смолу Зібера з навантаженням 0,71 ммоль/г. Застосовують загальну процедуру SPPS з такими модифікаціями: ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPS Розчинник для сполучення:DMF1Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH3×30 хв. цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв. промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.2Fmoc-L-Pro-OH3×30 хв, цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв. промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год. кімнатна температура3Fmoc-L-Pro-OH4×30 хв, цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв. промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год. кімнатна температура4Fmoc-L-Pro-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год., кімнатна температура.5Fmoc-L-Ala-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 сод. кімнатна температура.6Fmoc-Gly-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год. кімнатна температура.7Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год., кімнатна температура.8Fmoc-L-Ser(t-Bu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год. кімнатна температура.9Fmoc-L-Pro-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год., кімнатна температура.10Fmoc-Gly-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год. кімнатна температура. М'який режим гідролізу Препарату 1: Паралельно проводять десять однакових реакцій відщеплення захисної групи, кожна у масштабі П0,5 ммоль зв'язаного зі смолою Препарату 1, із застосуванням такого протоколу: 1) До 40 мл реактора з фритою додають 1,55 г (00,5 ммоль) зв'язаного зі смолою Препарату 1. 2) Смолу піддають набуханню в DMF (3×15 мл) (кожною разу протягом 15.хв). 3) Обробляють 20 % Pip/DMF (3×15 мл. кожною разу протягом 30 хв). 4) Промивають DMF (4×15 мл). а потім DCM (4×15 мл). 5) До кожного з п'яти 40 мл реакційних флаконів додають 1,5 мл TFA і 28,5 мл DCM. 6) До кожною з флаконів з розчином TFA додають одну п'яту зв'язаного зі смолою Препарату 1 (2,75 г), флакони закривають пробкою, і перемішують на роторному колесі протягом 5 хв. 7) Суміші фільтрують, промивають 100 мл DCM, і одержують загальний об'єм фільтрату 500 мл. 8) Фільтрати об'єднують, і переносять у круглодонну колбу, що містить 1000 мл МТВЕ. 9) Одержану суспензію концентрують, одержують масло світло-жовтого кольору, розтирають з 200 мл МТВЕ, і охолоджують на льодяній бані протягом 30 хв. 10) Тверду речовину відфільтровують, промішають 50 мл холодного МТВЕ, висушують у вакуумній печі· при температурі 33 °C протягом ночі, і одержують 5,35 г (вихід 91 %) твердої речовини білого кольору. Виділену тверду речовину досліджують із застосуванням ультра високоефективної рідинної хроматографії (98,57 % площі, з 0,99 % об'єднаних побічних продуктів відщеплення захисної групи t-Bu). Синтез Препарату 2 Послідовність SEQ ID NO: 3 Для синтезу застосовують смолу Fmoc-Gly-OH 2-CTC з навантаженням 0,61 ммоль/г. Застосовують загальну процедуру SPPS з такими модифікаціями: ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPS Розчинник для сполучєння: DMF1Fmoc-L-Ala-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.2Fmoc-L-Ile-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.3Fmoc-L-Leu-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/ 3,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.4Fmoc-L-Trp (Вос)-ОН3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.5Fmoc-L-Gln(Trt)-ОН3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 ΑΛ/3.3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.6Fmoc-L-Val-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи,3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.7Fmoc-L-Phe-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC 3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.8Fmoc-L-AIa-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год. кімнатна температура.9Fmoc-Lys(AlIoc)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 ΑA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.10Fmoc-L-Gln(Trt)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год., кімнатна температура.11Fmoc-L-Ala-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3.0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.12Fmoc-L-Ile-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.13Fmoc-L-Lys (Boc)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи. 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.14Fmoc-L-Asp(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура. М'який режим гідролізу Препарату 2: До 40 мл скляного сцинтиляційного флакона додають зв'язаний зі смолою Препарат 2 (3,06 г, 1,12 ммоль) та 30 мл 30 % розчину HFIP DCM, і там спостерігається зміна кольору на червоний. Вміст флакону перемішують на роторном) колесі при температурі навколишнього середовища протягом 1 год. Смолу відфільтровують, і промивають DCM (3×10 мл). Розчинник видаляють in vacuo, і одержують склоподібну піну (35 °C баня, 10 торр (1,33 кПа), 2,34 г), замінюють невеликою порцією ІРА (24 мл), після чого при кімнатній температурі краплями протягом 25 хв додають воду (24 мл). Одержаний розчин перемішують протягом 30 хв, і потім фільтрують. Відфільтрований осад промивають (3×10 мл) Н2О, після чого сушать у вакуумній печі при 25 торр (3,33 кПа) і температурі 35 °C протягом ночі. Це призводить до утворення Препарату 2 у вигляді твердої речовини білого кольору (1,81 г). Синтез Препарату 4 Послідовність SEQ ID NO: 4 Для синтезу застосовують смолу Fmoc-Leu-OH 2-CTC з навантаженням 0,68 ммоль/г. Застосовують загальну процедуру SPPS з такими модифікаціями: ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPS Розчинник для сиолучення: DMF1Fmoc-Aib-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Ftnoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.2Fmoe-L-Ile-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура.3Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.4Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.5Fmoc-L-Asp(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 AA/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.6Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.7Fmoc-L-Thr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma4 год, кімнатна температура.8Fmoc-L-Phe-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.9Fmoc-L-Thr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.10Fmoc-Gly-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.11Fmoc-L-Glu(tBu)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.12Fmoc-Aib-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.13Boc-L-Tyr(tBu)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура. Μ’який режим гідролізу Препарату 4: До 20 мл скляного сцинтиляційного флакона додають зв'язаний зі смолою Препарат 4 (2,0 г, 0,62 ммоль) та 10 мл 30 % розчину HFIP DCM, і там спостерігається зміна кольору на червоний. Вміст флакону перемішують на роторному колесі при температурі навколишньою середовища, потім смолу відфільтровують, промивають (3×2 мл) DCM, розчинник видаляють in vacua, і одержують склоподібну липку піну. Вказану піну розчиняють в 5,2 мл DMSO. Цей розчин разом з 6 мл води з однаковими швидкістями потоку протягом 45 хв (Ту15 °C) поєднують з 1 мл води. Після повного завершення додавання розчину пептиду, протягом 45 хв додатково додають 6 мл води. Під час додавання в осад випадає тверда речовина білого кольору. Одержану суспензію перемішують при температурі 15 °C протягом 30 хв. Тверду речовину відфільтровують, промивають 6 мл води, і потім переносять у вакуумну піч при температурі 35 °C та 25 торр (3,33 кПа). Препарат 4 (Boc-1-14-OH, 1,0763 г) одержують у вигляді пухнастої твердої речовини білого кольору. Синтез Препарату 3 із застосуванням LPPS Послідовність SEQ ID NO: 5 До 20 мл скляного сцинтиляційного флакона додають Препарат 2 (500 мг, 0,183 ммоль). Препарат 1 (179 мг, 0,175 ммоль) та DMSO (10 мл). До цього розчину додають спочатку DIEA (46 мкл, 0,265 ммоль), а потім РуВОР (бензотриазол-1-ілокси) трипіролідинофосфонію гексафторфосфат) (123 мг, 0,230 ммоль). Реакційну суміш перемішують протягом 2 год, потім додають діетиламін (DEA) (183 мкл, 1,77 ммоль), і одержаний розчин перемішують протягом 2 год. Реакційну суміш відбирають у шприц, і додають у 50 мл колбу з перемішуваним вмістом з одночасним додаванням краплями води (12 мл) протягом 1 год. Після завершення додавання осаджений продукт відфільтровують, і промітають водою (2×4 мл). Вологий відфільтрований осад сушать під вакуумом при температурі 35 °C протягом 18 год, і одержують Препарат 3 у вигляді твердої речовини білого кольору (0,6003 г, вихід 88 %, HRMS з обчисленням для С184Н261N31О38, очікуваний результат: 3512,9444, фактичний результат: 3512,9430). Синтез Препарату 5 із застосуванням LPPS Послідовність SEQ ID NO: 6 До 20мл скляного сцинтиляційного флакона додають Препарат 3 (338,8 мг, 0,091 ммоль), Препарат 4 (192,1 мг, 0,091 ммоль) та DMSO (10 мл). До цього розчину додають спочатку РуВОР (63,5 мг, 0,118 ммоль), а потім DIEA (79 мкл, 0,454 ммоль). Реакційну суміш перемішують протягом 2,5 год. Реакційну суміш відбирають у шприц, і вміст додають у 50 мл колбу з перемішуваним вмістом з одночасним додаванням краплями води (12 мл) протягом 1 год. Після завершення додавання осаджений продукт відфільтровують, після чого промивають водою (2×4 мл). Вологий відфільтрований осад сушать під вакуумом при температурі 35 °C протягом 18 год, і одержують Препарат 5 у вигляді твердої речовини білого кольору (0,3568 г, вихід 70 %, HRMS з обчисленням для C293H435N45O64, очікуваний результат: 5608,2168, фактичний результат: 5608,2066). Синтез Препарату 6 за Методом 1 (LPPS) Приклад 1 Ейкозандіоєвої кислоти моно(1,1-лиметилетиловий) складний ефір (15,0 кг. обмежувальний реагент) та N-гідроксисукцинімід (1,2 екв) розчиняють у етилацетаті мри температурі 27 °C. Додають розчин DCC (1,25 екв.) в етилацетаті, і реакційну суміш перемішують протягом 24 год при температурі 22 °C. Одержаний побічний продукт DCU відфільтровують, після чого органічну фазу тричі екстрагують 5 % водним розчином NaCl. Після екстракції органічну фазу концентрують, випаровують з ізопропанолом, а потім кристалізують додаванням гептану. Після фільтрування відфільтрований осад промивають гептаном, висушують при температурі 25 °C, і одержують 17,0 кг напівпродукту INT1 з виходом 87 % та чистотою 99 %. H-Glu-OtBu (7,7 кг, 1,1 екв.) розчиняють у DCM (54 л) при температурі 20 °C, потім додають розчин TMSA (11,3 кг) у DCM (7 л), після чого реакційну суміш перемішують протягом 1 год при температурі 40 °C. При кімнатній температурі додають розчин INT1 (17,0 кг) у DCM, і перемішують протягом 8 год. Після завершення реакції DCM замінюють на етилацетат шляхом дистиляції. Органічну фазу тричі промивають 2 % водним розчином KHSO4/NaCl, потім 4 рази промивають 2 % водним розчином NaCl. Після відокремлення та видалення водних фаз органічну фазу концентрують з ізопропанолом, розбавляють ізопропанолом, і потім кристалізують додаванням води. Після фільтрування відфільтрований осад промивають сумішшю вода/ізопропанол, потім сушать при температурі 30 °C, і одержують 17,3 кг INT2 з виходом 86 % та чистотою 99 %. INT 2 (17,3 кг) та N-гідроксисукцинімід (4,1 кг, 1,2 екв.) розчиняють у етилацетаті (336 кг) при температурі 27 °C. Додають розчин DCC (8,33 кг, 1,25 екв.) в етилацетаті, і реакційну суміш перемішують протягом 24 год при температурі 22 °C. Одержаний побічним продукт DCU відфільтровують. Органічну фазу концентрують, випаровують з ізопропанолом. а потім кристалізують охолодженням розчину ізопропанолу (а125 л). Після цього відфільтрований осад промивають холодним ізопропанолом, сушать при температурі 25 °C, і одержують 16,3 кг INT 3 з виходом 81 % та чистотою 96 %. 17-аміно-10-оксо-3,6,12,15-тетраокса-9-азагептадеканову кислоту (AΕΕΑ2) (8,1 кг, 26,3 моль) суспендують в DCM (54 л) при температурі 22 °C, додають розчин TMSA (7,68 кг, 59,9 моль) в DCΜ (6,2 л), і потім реакційну суміш перемішують протягом години при температурі 40 °C. ΙΝΤ 3 (16 кг) суспендують у DCM (31 л) при температурі 35 °C, і додають до TMS-захищеної суміші (АЕЕА2) при температурі 22 °C. Реакційну суміш перемішують протягом 12 год, після завершення реакції суміш концентрують, а потім заміщують на етилацетат. Органічну фазу тричі промивають 2 % водним розчином KHSO4/NaCl (/200 л), і потім 4 рази 2 % водним розчином NaCl (2200л) до цільового значення рН 4,5. Органічну фазу концентрують, і заміщують на ацетонітрил. Розчин в ацетоні грилі охолоджують до температури -20 °C, і потім витримують одержану суспензію протягом 15 год. при температурі -20 °C. Суміш фільтрують, відфільтрований осад промивають холодним ацетонітрилом, і сушать при температурі <0 °C для одержання 18,4 кг Препарату 6 (вихід 88 %) із чистотою 96 %. Загальний вихід = 53 %. Синтез препарату 6 за Методом 2 (SPPS) Як альтернатива. Препарат 6 можна одержати із застосуванням твердофазного синтезу пептидів, застосовуючи синтезатор пептидів. Застосовують стандартні процедури сполучення. Стандартні умови сполучення: 0,133 М, 2,0 екв. НАТU, 5,0 екв. DIEA, температура навколишнього середовища, 3 год, відщеплення захисної групи (3×15 хв) 20 % розчином піперидину у DMF. Завантаження смоли: FmocNH-AEEA на смолі 2-СТС (0,99 ммоль/г): 1,01г у кожній з паралельних реакцій. Автоматична програма із застосуванням набухання у DMF, а потім у Pip/DMF; промивка DMF; та амінокислота, DIEA, суміш HATU; і цикли промивання DMF з подальшим сушінням. Смолу розщеплюють перемішуванням об'єднаних партій у суміші 30 % HFIP/DCM (240 мл) протягом 1,5 год. Смолу фільтрують, промивають, і розчинник видаляють з фільтрату in vacua. Одержане масло розчиняють в ацетонітрилі, і розчинник знову видаляють. Ця операція надає 30,47 г (146 % теоретичного виходу) в'язкого масла жовтого кольору, що містить 52,3 % площі бажаного продукту за результатами аналізу із застосуванням ультра високоефективної рідинної хроматографії. Неочищений продукт очищають флеш-хроматографією (500 г силікагелю, елюювання 85 % DCM/10 % метанолу/5 % оцтової кислоти, зібрано 38×100 мл фракцій). Попередньо хроматографований концентрат (17,94 г) кристалізують, і одержують 13,4 г (вихід 74,7 %). з чистотою 91,65 % площі за даними ультра високоефективної рідинної хроматографії. Приклад 1 Приклад 1 синтезу Послідовність SEQ ID NO: 1 До першого флакона для ВЕРХ додають Препарат 5 (10,5 мг, 0,00187 ммоль) та DCM (200 мкл, 20л/кг). До цього розчину додають розчин фенілсилану (0,81 Μ у DCM, 22,1 мкл. 0,0178 ммоль) та тетракіс(трифенілфосфін)-паладію(0) (0,8 М у DCM, 22,1 мкл, 0,00064 ммоль). Цей розчин перемішують при температурі 24 °C протягом однієї години для одержання невиділеного розчину Препарату 7 (послідовність SEQ ID NO: 7). До другого флакона для ВЕРХ додають спочатку DCM (150 мкл), потім Препарат 6 (0,118 Μ в DCM, 16 мкл, 0,00189 ммоль), РуВОР (0,186 Μ в DCM, 16 мкл, 0,00298 ммоль) і DIEA (0,573 Μ в DCM, 5 екв.). Вміст другого флакона додають у перший флакон, і реакційну суміш перемішують протягом 1 год для одержання невиділеного розчину Препарату 8 (послідовність SEQ ID NO: 8). Розчин Препарату 8 концентрують під вакуумом, і до одержаної твердої речовини додають 50 мкл розчину трифтороцтової кислоти (4,65 мл), триізопропілсилану (20 мкл) і DTT (20мг). Вказану суспензію перемішують протягом 18 год, і контролюють із застосуванням ВЕРХ для підтвердження утворення сполуки Прикладу 1 (HRMS з обчисленням для C225H348N48O68, очікуваний результат: 4810,5249, фактичний результат: 4810,5257). Синтез препарату 9 Послідовність SEQ ID NO: 9 Амідну смолу Зібера (13,42 г, 0,75 ммоль/г, 10,1 ммоль) суспендують у DMF (130 мл, 10 об'ємів) протягом приблизно 20 хв, а потім зливають. Одержану смолу промішають DMF (80 мл, 6 об'ємів) приблизно протягом 5 хв. Групу Fmoc видаляють обробкою Fmoc-амінокислотної смоли 5 % (об'ємн.) піперидину, 1,25 % (об'ємн.) DBU, 1,0 % (мас.) розчину HOBt/DMF (80 мл, 6 об'ємів) двічі протягом 10 хв і 20 хв, відповідно. Після зливання розчину з відщепленою захисною групою Fmoc двічі промивають DMF (80 мл, 6 об'ємів), двічі МТВЕ (80 мл, 6 об'ємів) і ще двічі DMF (80 мл, 6 об'ємів). Амінокислотний ланцюг складають із застосуванням стандартної Fmoc-хімії. Зазвичай 1,5 екв Fmoc-амінокислоти та HOBt (2,47 г, 20 % зволожений, 14,6 ммоль, 1,46 екв) розчиняють у DMF (60 мл, 4,5 об'єми) з подальшим додаванням DIEA (1,94 мл, 11,1 ммоль. 1,11 еквівалент). Одержаний розчин охолоджують до температури <5 °C на льодяній бані, та активують додаванням TBTU (4,83 г, 15,0 ммоль, 1,5 екв). Дозволяють відстоюватися протягом приблизно 5 хв при температурі 0-5 °C. До смоли додають спочатку DCM (60 мл, 1,5 об'єми) з подальшим додаванням активованого розчину Fmoc-амінокислоти. Одержану суміш перемішують при температурі близькій температурі навколишнього середовища протягом 2 год. Послідовно повторюють процедуру відщеплення захисної групи Fmoc та сполучення з рештою амінокислот. Після завершення останньої процедури відщеплення захисної групи Fmoc, смолу двічі промивають 2-пропанолом (130 мл, 10 об'ємів) протягом 5 хв, потім промивають МТВЕ (130 мл, 10 об'ємів) шість разів. Смолу сушать при температурі 35 °C in vacua, і одержують Препарат 9 на смолі Зібера (21,21 г, теоретично 0,435 ммоль/г, вихід 91,7 %, взявши за основу збільшення маси). Частину комплексу Препарат 9-смола (10,15 г, 0,435 ммоль/г, 4,41 ммоль) обробляють 5 % (об'ємн.) розчином TFA у DCM (101 мл, 10 об'ємів), і здійснюють етап промивання DCM. Фракції розщеплення та змиви нейтралізують DIEA (26,29 г, 35,5 мл, молярне відношення до TFA 1,01:1). Фракції об'єднують, і концентрують у вакуумі до 50 % від початкового об'єму. Розчин DCM промивають насиченим водним розчином NaHCO3 (2×94 мл). Одержаний розчин сушать над безводним MgSO4, і концентрують насухо для одержання смолистої твердої речовини. Повторно суспендують згадану смолиста тверду речовину при температурі <5 °C у МТВЕ (100 мл) для руйнування камеді і одержання суспензії білого кольору. Згадану суспензію білого кольору фільтрують, промивають, сушать, і одержують Препарат 9 (3,84 г, 92,3 % площі, 37,8 % (мас.) DIEA1TFA, 57,4 % (мас.), 2,29 ммоль, вихід 51,9 %, HRMS з обчисленням для C46H78N10O12, очікуваний результат: 962,5801, фактичний результат: 962,5806) у вигляді порошку білого кольору. Синтез препарату 10 Послідовність SEQ ID NO: 10 Комплекс смол Fmoc-Gly-Gly-O-2CTC (18,09 г, 0,57 ммоль/г, 10,3 ммоль) суспендують у DMF (180 мл, 10 об'ємів) протягом 20 хв, і потім зливають. Одержану смолу промивають DMF (108 мл, 6 об'ємів) протягом 5 хв. Групу Fmoc видаляють обробкою Fmoc-амінокислотної смоли 5 % (об'ємн.) піперидину, 1,25 % (об'ємн.) DBU, 1,0 % (мас.) розчину HOBt/DMF (80 мл, 6 об'ємів) двічі протягом 10 хв і 20 хв, відповідно. Розчин з відщепленою захисною групою Fmoc зливають, і смолу двічі промивають DMF (110 мл, 6 об'ємів), двічі МТВЕ (110 мл, 6 об'ємів) і ще двічі DMF (110 мл, 6 об'ємів). Складання ланцюга проводять за стандартною Fmoc-хімією. Для сполучення амінокислот зазвичай 1,5 екв Fmoc-амінокислоти та НОВt (2,54 г, 20 % зволожений водою, 15,0 ммоль, 1,5 екв.) розчиняють у DMF (80 мл, 4,4 об'єма), і потім для забезпечення сполучення амінокислот додають DIEA (1,94 г, 15,0 ммоль, 1,5 екв.). Одержаний розчин охолоджують до температури 0-5 °C на льодяній бані, і активують додаванням 2-(1Н-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметиламінію тетрафторборату (TBTU) (4,84 г, 15,1 ммоль, 1,5 екв). Надають можливість відстоятися протягом 5 хв при температурі 0-5 °C. Після цього до смоли додають спочатку DCM (35 г, 1,5 об'єму), а потім активований розчин Fmoc-амінокислоти. Одержану суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 2 год. Після завершення цих етапів синтезу пептидну смолу двічі промивають 2-пропанолом (180 мл, 10 об'ємів) протягом 5 хв, а потім МТВЕ (180 мл, 10 об'ємів кожного разу, 6 разів) з подальшим висушуванням при температурі 35 °C для одержання комплексу Препарату 10 і смоли (25,52 г, 0,216 ммоль/г, вихід 53,6 %). Частину комплексу Препарату 10 і смоли (10.075 г. 0,216 ммоль/г, 2,18 ммоль) тричі обробляють розчином 1 % (об'ємн.) TFA у DCM (100 мл, 10 об'ємів), і промивають DCM (75 мл, 7,5 об'єма). Фракції після розщеплення нейтралізують, та промивають піридином (3,18 г, мольне співвідношення з ГРА 1,01:1). Фракції об'єднують, і концентрують у вакуумі досуха при температурі и35 °C. Проводять відновлення із застосуванням етанолу (40 мл, 10 % (об'ємн.) об'єднаних фільтратів) з подальшим концентруванням насухо. Нарешті, пептид розтирають при перемішуванні в деіонізованій воді (150 мл, 40 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів). Твердий неочищений пептидний осад збирають центрифугуванням, і двічі промивають деіонізованою водою (по 150 мл кожного разу). Тверду речовину двічі промивають н-гептаном (по 100 мл кожного разу), виділяють, та висушують in vacuo при температурі 40 °С для одержання Препарату 10 (послідовність SEQ ID ΝΟ: 10) у вигляді хрусткої твердої речовини світло-жовтого кольору (4,10 г, 72,4 % площі, 3,0 % (мас.) піридинпTFA, 70,2 % (мас.), 1,85 ммоль, вихід 85,1 %, HRMS з обчисленням для C88H103N11O15, очікуваний результат: 1553,7635, фактичний результат: 1553,76556). Синтез препарату 11 Послідовність SEQ ID NO: 11 Комплекс смол Н-аланін-О-2СТС (40,39 г, 0,5 ммоль/г, 20,20 ммоль) суспендують у DMF (400 мл, 10 об'ємів) протягом приблизно 20 хв, а потім зливають. Одержану смолу двічі промивають DMF (400 мл, 10 об'ємів) протягом 5 хв. Амінокислотний ланцюг складають із застосуванням стандартної Fmoc-хімії. Зазвичай 1,5 екв Fmoc-амінокислоти та HOBt (5,51 г, 80 % (мас.), 36,2 ммоль, 1,6 екв) розчиняють у DMF (150 мл. 3,7 об'єми) з подальшим додаванням DIEA (4,22 г, 32,7 ммоль, 1,6 екв). Одержаний розчин охолоджують до температури приблизно <5 °C на льодяній бані, та активують додаванням TBTU (10,39 г, 32,4 ммоль, 1,6 екв). Дозволяють перемішуватися протягом приблизно 5 хв при температурі 0-5 °C. До смоли додають DCM (80 мл, 2 об'єми) з подальшим додаванням активованого розчину Fmoc-амінокислоти. Одержану суміш перемішують приблизно при температурі навколишнього середовища протягом 2 год. Групу Fmoc видаляють обробкою Fmoc-амінокислотної смоли 5 % (об'ємн.) піперидину, 1,25 % (об'ємн.) DBU, 1,0 % (мас.) розчину HOBt/DMF (240 мл, 6 об'ємів) двічі протягом 10 хв і 20 хв, відповідно. Розчин з відщепленою захисною групою Fmoc зливають, смолу двічі промивають DMF (240 мл, 6 об'ємів), двічі МТВЕ (240 мл, 6 об'ємів) і ще двічі DMF (240 мл, 6 об'ємів). Після завершення цих етапів синтезу пептидну смолу ретельно промивають 2-пропанолом (400 мл, 10 об'ємів) двічі та МТВЕ (400 мл, 10 об'ємів кожного разу, 6 разів), і потім сушать in vacua при температурі 35 °C з виходом завантаженої смоли меншим ніж кількість останньої амінокислоти (74,82 г, 0,159 ммоль/г, 11,90 ммоль, вихід 58,9 %). Останню амінокислоту, Fmoc-Leu-ΟΗ, окремо додають до порції смоли (13.61 г, 0,159 ммоль/г, 2,16 ммоль). Ця смола набухає у DMF (130 мл, 10 об'ємів, 3 рази) протягом >5 хв кожного разу, після чого здійснюють відщеплення захисної групи (130 мл суміші для відщеплення захисної групи, приготовленої з 5,6 г піперидину, 1,67 г DBU, 1,3 г HOBt у 120 мл DMF, 10 об'ємів, двічі) через 10 хв і 20 хв. Смолу промивають спочатку DMF (80 мл, 6 об'ємів, двічі), потім МТВЕ (80 мл, 6 об'ємів, двічі), і потім DMF (80 мл, 6 об'ємів, двічі) протягом 5 хв кожного разу. Розчиняють у DMF (50 мл, 3,7 об'єма) з подальшим додаванням DIEA (0,54 і, 4,2 ммоль, 1,9 екв для сполучення Fmoc-Leu-ΟΗ, Fmoc-Leu-OH (1,47 г, 4,16 ммоль, 1,9 екв) і HOBt (0,704 г, 80 % (мас.), 4,17 ммоль, 1,9 екв)). Одержаний розчин охолоджують до <5 °C на льодяній бані, та активують додаванням TBTU (1,34 г, 4,17 ммоль, 1,9 екв), і дозволяють перемішуватися протягом 5 хв при температурі 0-5 °C. До смоли додають DCM (20 мл, 1,5 об'єма) з подальшим додаванням активованого розчину Fmoc-амінокислоти. Одержану суміш перемішують при приблизно температурі навколишнього середовища протягом 2 год. Цю смолу промивають DMF (180 мл, 13 об'ємів, двічі), МТВЕ (180 мл, 13 об'ємів, двічі) та DMF (180 мл, 13 об'ємів, двічі) протягом 5 хв кожного разу. Смолу промивають DCM (130 мл, 10 об'ємів, 6 разів, кожного разу протягом 5 хв) перед сушінням смоли in vacua при температурі 35 °C, і одержують навантажену смолу (12,90 г, 0,203 ммоль/г, 2,62 ммоль, вихід 121 %). Частину смоли (7,09 г, 0,203 ммоль/г, 1,44 ммоль) тричі обробляють 1 % (об’ємн.) розчином TFA у DC Μ (70 мл. 10 об'ємів) протягом 10 хв кожного разу при температурі приблизно навколишнього середовища з подальшим промиванням DCM (55 мл, 7,5 об'єма). Фракції після розщеплення, нейтралізують, і промивають піридином (3,02 г, молярне співвідношення 1.02:1 до TFA). Фракції об'єднують, та концентрують у вакуумі досуха при температурі н35 °C. Здійснюють відновлення етанолом (28 мл, 11 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів) з подальшим концентруванням насухо. Нарешті, пептид перемішують у деіонізованій воді (105 мл, 40 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів). Твердий неочищений пептидний осад відфільтровують, і промивають деіонізованою водою (4×50 мл). Тверду речовину промивають н-гептаном (3×100 мл). ізолюють, та висушують in vacua при температурі 40 °C для одержання Препарату 11 у вигляді порошку білого кольору (4,54 г, 87,6 % площі, 44,4 % (мас.) піридин0TFA, 48,7 % (мас.), 0,936 ммоль, вихід 65,0 %. HRMS з обчисленням для C127H192N14O28, очікуваним результат: 2361,4031, фактичний результат: 2361,4021), Загальний вихід для одержання Препарату 11 на смолі становить 71,3 %. Синтез Препарату 12 Послідовність SEQ ID NO: 12 Комплекс смол Fmoc-Aib-O-CTC (19,16 г, 0.54 ммоль/г, 10.35 ммоль) суспендують у DMF (190 мл, 10 об'ємів) протягом 20 хв, а потім зливають. Одержану смолу промивають DMF (190 мл, 10 об'ємів) протягом 5 хв. а потім зливають. Для одержання розчину 5 % піперидину, 1,25 % DBU, 1,0 % HOBt/DMF у вигляді розчину для відщеплення захисної групи об'єднують піперидин (77,82 г), DBU (23,16 г), HOBt (18,09 г, 80 % (об'емн.) і DMF (1800 мл). Групу Fmoc видаляють обробкою Fmoc-амінокислотної смоли розчином для відщеплення захисної групи (190 мл, 10 об'ємів) двічі протягом 10 хв і 20 хв, відповідно. Розчин з відщепленою захисною групою Fmoc зливають, потім смолу двічі промивають DMF, двічі МТВЕ і ще двічі DMF (190 мл, 10 об'ємів для кожного промивання). До розчину Fmoc-lle-OH (7,11 г, 10,1 ммоль, 2,0 екв) у DMF (85 мл) додають DIEA (2,62 г, 20,3 ммоль, 2,0 екв). Одержаний розчин охолоджують до температури 0-5 °C, додають 6-хлорбензотриазол-1-ілокси-трис-піролідинофосфонію гексафторфосфат (РуСІоск) (11,36 г, 20,06 ммоль, 2,0 екв), і повністю розчиняють. Активований розчин додають до попередньо підданого набуханню у DCM (30 мл, 1,5 об'єма) комплексу смол H-Aib-О-СТС після відстоювання протягом 3-5 хв. Реакційній суміші дозволяють нагріватися до температури навколишньою середовища, і перемішують протягом 2 год. Непрореагувавший матеріал становить приблизно 18 %, як свідчить результат оцінювання даних дослідження. Двічі промивають DMF, двічі МТВЕ і двічі DMF (190 мл, 10 об'ємів для кожного промивання). Розчин Fmoc-Ile-OH (10,63 г, 30,08 ммоль, 6 екв) у DMF (165 мл) додають до Oxyma (50 мл, 0,6 Μ у DMF. 30 ммоль, 6 екв) та DIC (50 мл, 0,66 Μ в DMF, 33 ммоль, 6,6 екв). Перемішують протягом 5 хв приблизно при температурі навколишнього середовища, а потім додають до смоли, і перемішують протягом 18 год. До смоли додають суміш піридину, оцтового ангідриду та DMF, і перемішують протягом 0,5 год. Смолу промивають DMF (5×140 мл, 7 об'ємів.), додатковою кількістю DMF(2×180 мл, 9 об'ємів), МТВЕ (2×180 мл, 9 об'ємів), потім DMF (2×180 мл, 9 об'ємів). Складання решти ланцюга проводять за стандартною Fmoc-хімією послідовно для решти амінокислот. Зазвичай Fmoc-амінокислоту (2,0 екв), HOBt (3,42 г, 80 % (мас.), 2,0 екв) розчиняють у DMF (85 мл) з подальшим додаванням DIEA (2,64 г, 2,0 екв). Одержаний розчин охолоджують до температури 0-5 °C на льодяній бані, активують додаванням ТВTU (6,45 г, 2,0 екв), і дозволяють відстоюватися протягом 3-5 хв при температурі 0-5 °C. До смоли додають DCΜ (30 мл) з подальшим додаванням активованого розчину Fmoc-амінокислоти. Одержану суміш перемішують при кімнатній температурі протягом 2 год. Одержану смолу двічі промивають DMF, двічі МТВЕ і ще двічі DMF (190 мл, 10 об'ємів на кожне промивання). Групу Fmoc видаляють обробкою Fmoc-амінокислотної смоли розчином для відщеплення захисної групи (190 мл, 10 об'ємів) двічі протягом 10 хв і 20 хв, відповідно. Після зливання розчину з відщепленою захисною групою Fmoc смолу промивають двічі DMF, двічі МТВЕ і ще двічі DMF (190 мл, 10 об'ємів на кожне промивання). Тетрамер Boc-Y-Aib-E(tBu)G-OH (12,25 г, 2,0 екв) в DMF (50 мл) активують із застосуванням Oxyma (30 мл 0,6 Μ в DMF, 20 ммоль, 2 екв) і DIC (33 мл 0,66 М, 22 ммоль, 2,1 екв.) протягом 5 хв для додавання останніх чотирьох амінокислот у вигляді тетрамеру. Цю суміш додають до смоли, і сполучають протягом 18 год. Суміш зливають наприкінці 18 год., і смолу промивають DMF (190 мл, 5 разів протягом 5 хв кожного разу). Додають додаткову кількість тетрамеру (6,21 г, 1,0 екв) и DMF (40 мл), активують із застосуванням РуВОР (5,77 г, 1,1 екв) та DІEA (3,32 г, 2,6 екв) протягом 5 хв перед додаванням цієї суміші до смоли, і перемішують протягом 4 год. Суміш зливають через 4 год, промивають DMF (190 мл, 5 разів протягом 5 хв кожною разу). Кепірування смоли здійснюють шляхом додавання до смоли суміші DMF (105 мл), піридину (13,48 г, 17 екв) та оцтового ангідриду (14,27 г, 14 екв), і перемішують протягом 1 год. Пептидну смолу промивають після завершення складання ланцюга п'ять разів протягом 5 хв кожного разу DMF (190 мл кожного разу), шість разів DCM (190 мл кожного разу), і потім сушать у вакуумі при температурі 35 °C для одержання комплексу Препарату 12 і смоли (31,03 г, 0,2595 г/ммоль теоретично, 8,05 ммоль, вихід 77,8 %). Частину комплексу Препарату 12 і смоли (15,975 г, 0,2595 ммоль/г, 4,146 ммоль) тричі обробляють 1 % (об’ємн.) розчином TFA у DCM (160 мл, 10 об'ємів) протягом 10 хв кожного разу при температурі навколишнього середовища з подальшим промиванням DCM (120 мл, 7,5 об'єма). Фракції після розщеплення нейтралізують, і промивають піридином (4,74 г, молярне співвідношення 0,94:1 до TFA). Фракції об'єднують, і концентрують у вакуумі досуха при температурі т35 °C. Відновлення здійснюють етанолом (30 мл, 5 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів) з подальшим концентруванням насухо. Пептид механічно перемішують у деіонізованій воді (242 мл, 40 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів) протягом 10 хв. Твердий неочищений пептид відфільтровують, і промивають деіонізованою водою (4×100 мл). Тверду речовину промивають н-гептаном (4×100 мл), ізолюють, і висушують in vacua при температурі 35 °C для одержання Препарату 12 у вигляді порошку білого кольору (9,38 г, 82,2 % площі, 0,2 % (мас.) піридиніТFА, 82,1 % (мас.), 3,85 ммоль, вихід 92,8 %, HRMS з обчисленням для C103H165N13O26, очікуваний результат: 2000,1989, фактичний результат: 2000,1968). Синтез препарату 13 Послідовність SEQ ID NO: 13 У колбу в атмосфері N2 додають Препарат 9 (2,887 г, 70,2 % (мас.), 1,30 ммоль), Препарат 10 (3,576 г, 57,4 % (мас.), 2,13 ммоль, 1,63 екв.), DMSO (18,1 г, 16,4 мл), DMF(15,8 г, 16,7 мл) та DІEA (655 мг, 5,07 ммоль, 3,89 екв.) при перемішуванні до одержання розчину золотистого кольору. Цей розчин охолоджують у воді і льодом перед додаванням РуВОР (1,414 г, 2,72 ммоль, 2,08 екв). Ванну з льодом видаляють, і суміші дозволяють нагрітися до температури навколишньою середовища. Перебіг реакції контролюють протягом приблизно 5 год, щоб забезпечити адекватне перетворення. Аліквоту діетиламіну (2,116 г, 28,9 ммоль, 22,2 екв.) додають до реакційної суміші, що мас температуру навколишнього середовища. Суміш перемішують протягом приблизно години для забезпечення приблизно >99 % перетворення на Препарат 13. Продукт осаджують додаванням суміші з температурою <4 °C, що містить насичений водний розчин NaHCО3 (50 мл) і деіонізовану воду (50 мл). Суміш перемішують в умовах холоду протягом щонайменше приблизно 15 хв. Каламутно-білу суспензію фільтрують. Вологий відфільтрований осад промивають спочатку деіонізованою водою (3×50 мл), потім МТВЕ (6×50 мл), і сушать при температурі 40 °C in vacua з продуванням Ν2 протягом приблизно 62 год. В результаті процесу одержують Препарат 13 (4,45 г, 60,4 % площі, 16,4 % площі дибензофульвену, 1,18 ммоль, вихід 90,5 %, HRMS з обчисленням для С119Н169Ν21О24. очікуваний результат: 2276,2649, фактичний результат: 2276,2550) у вигляді твердої речовини світло-жовтого кольору. Синтез препарату 14 Послідовність SEQ ID NO: 14 Аліквоту Препарату 11 (3,012 г, 48,7 % (мас.), 0,621 ммоль, 1,00 екв.) додають у колбу у атмосфері N2 з Препаратом 13 (3,951 г, 60,4 % (мас.), 1,05 ммоль, 1,69 екв), DMSO (9,8 г, 8,9 мл), DMF (52,0 г, 55,0 мл) та DІEA (372 мг, 2,88 ммоль, 4,63 екв). Суміш перемішують до одержання розчину золотистого кольору. Цю суміш охолоджують у воді з льодом до температури <10 °C. До суміші додають аліквоту РуВОР (742 мг, 1,42 ммоль, 2,30 екв.). Ванну з льодом видаляють, і суміші дозволяють нагрітися до температури приблизно навколишньою середовища. Перебіг реакції контролюють протягом приблизно 22 год, щоб забезпечити адекватне перетворення на Препарат 14. Це дає приблизно >96 % перетворення. Піперидин (530 мг, 6,22 ммоль, 10,0 екв) додають до охолодженої реакційної суміші при температурі <10 °C. Суміш перемішують при температурі навколишнього середовища протягом приблизно 2 год, щоб забезпечити приблизно >99 % перетворення на Препарат 14. Реакційну суміш додають в іншу колбу, що містить 0,5н водний розчин НСІ (12,72 г, 6,23 ммоль, 10,0 екв.), і деіонізовану воду (16,71 г), яка має температуру <4 °C, щоб забезпечити осадження Препарату 14. Холодну суспензію перемішують протягом приблизно 15 хв, і суспензію білого кольору фільтрують. Вологий відфільтрований осад промивають деіонізованою водою (2×30 мл), насиченим водним розчином NaHCО3 (2×30 мл), деіонізованою водою (3×30 мл) та МТВЕ (4×45 мл), і сушать при температурі 40 °C in vacua з продуванням N2 протягом приблизно 17 год. Продукт, Препарат 14 (5,418 г, 48,9 % площі, 0,603 ммоль, вихід 97,0 %. HRMS з обчисленням для C231H349N35O49, очікуваний результат: 4397,5893, фактичний результат: 4397,6057), одержують у вигляді порошку білого кольору. Синтез препарату 15 Послідовність SEQ ID NO: 15 В колбу у атмосфері N2 додають аліквоту Препарату 12 (671 мг, 82,1 % (мас.), 0,275 ммоль. 1,23 екв). До згаданої колби з перемішуванням додають Препарат 14 (2,009 г, 48,9 % площі, 10,7 % площі ізомеру, 0,223 ммоль, 1,00 екв). DMSO (11,1 г, 10,0 мл), DMF (19,0 г, 20,1 мл) та DIEA (76 мг, 0,588 ммоль, 2,63 екв), і одержують розчин золотистого кольору. Перед охолодженням до температури -5 °C додають аліквоту 0,6 Μ HOAt (619 мг, 0,384 ммоль, 1,72 екв). Додають зразок РуСІоск (220 мг, 0,397 ммоль, 1,78 еквівалента). Суміші дозволяють нагрітися приблизно до температури навколишнього середовища, щоб забезпечити приблизно 84 % перетворення на Препарат 15. Продукт виділяють, додаванням реакційної суміші протягом 10 хв до деіонізованої води (548 мл), що має температуру танення льоду, в результаті чого продукт випадає в осад. Реакційну колбу промивають DMF (5 мл), і змив додають до суспензії. Суспензію перемішують протягом приблизно 15 хв. дозволяють нагрітися до температури навколишнього середовища, і фільтрують. Вологий відфільтрований осад промивають деіонізованою водою (3×80 мл), і воскоподібну тверду речовину білого кольору сушать при температурі 35 °C протягом 3,5 днів in vacua для одержання Препарату 15 (2,506 г, 41,6 % площі, 0,163 ммоль, вихід 73,1 %, HRMS з обчисленням для C334H512N48O74, очікуваний результат: 6379,7777, фактичний результат: 6379,8652) у вигляді порошку білою кольору. Приклад 2 Синтез сполуки Прикладу 2 Послідовність SEQ ID NO: 1 В колбу у атмосфері N2 додають зразок TFA (19,656 г, 13,03 мл) з DCM (815 мг, 0,62 мл). DTT (434 мг) і TIPS (362 мг, 0,47 мл). Перед додаванням води (468 мг, 0,47 мл) суміш охолоджують у воді з льодом. До цієї суміші при температурі 2 °C для одержання розчину додають зразок Препарату 15 (1016 мг, 39,0 % площі, 0,0620 ммоль). Суміш нагрівають приблизно до температури навколишнього середовища, і перемішують протягом приблизно 2 год. Реакційну суміш додають до МТВН (150 мл) при температурі -15 °C, і ополіскують реактор МТВЕ (3 мл). Суспензію центрифугують приблизно через 10 хв, і декантують супернатант. Вологий відфільтрований осад повторно суспендують у МТВЕ (3×50 мл), центрифугують при кожному промиванні, і декантують супернатант. Вологий відфільтрований осад сушать при температурі 35 °C in vacua, і одержують сполуку Прикладу 2 (784 мг, 26,5 % площі, 0,0432 ммоль, вихід 69,7 %, HRMS з обчисленням для C225H348N48O68, очікуваний результат: 4810,5249, фактичний результат: 4810,5642) у вигляді твердої речовини білого кольору. Синтез препарату·16 Послідовність SEQ ID NО: 16 Для синтезу використовують Fmoc-Gly-OH-2-хлортритилову смолу із навантаженням 0,61 ммоль/г. Загальна процедура SPPS по суті така, як описана в цьому описі. Препарат 16 одержують в результаті м'якого режиму гідролізу пептиду на смолі так, як описано в цьому описі, із застосуванням методів, відомих фахівцям. Відновлення концентрованого матеріалу здійснюють етанолом (5 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів), і концентрують насухо. Пептид розтирають при перемішуванні у воді (40 % (об’ємн.) об'єднаних фільтратів). Тверду речовину виділяють, сушать у вакуумі при температурі 40 °C до постійної маси, і одержують 5,24 г (99 %) Препарату 16 у вигляді порошку білого кольору. Синтез препарату 18 Послідовність SEQ ID NО:17 Для синтезу застосовують Fmoc-Ale-OH-2-хлортритилову смолу з навантаженням 0,50 ммоль/г. Загальну процедуру SPPS застосовують по суті так, як описано в цьому описі, із такими модифікаціями: ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPSРозчинник для сполччення: DМFПримітки1(52S)-52-((((9Н-флуорен-9-іл)метокси)карбоніл) аміно)-25-(трет-бутоксикарбоніл)-2,2-диметил-4,23,28,37,46-пентаоксо-3,32,35,41,44-пентаокса-24,29,38,47-тетраазатрипентаконтан-53-ова кислотаЦикли відщеплення захисної групи Fmoc із застосуванням DBU/HOBt тривалістю 10 хв і 20 хв, промивання після відщеплення захисної групи (6×2 хв), 1,7 АА/3,0 HOBt/3,0 TBTU/3,0 DIEA 2 год, кімнатна температура.Препарат 172Fmoc-L-Gln(Trt)-OH10 хв та 20 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 1. 3,0 АА/3,0 HOBt/3,0 TBTU/3,0 DIEA, 2 год, кімнатна температура. 2. Повторне сполучення 1,5 АА/1,5 HOBt/1,5 TBTU/1,5 DIEA протягом 4 год при кімнатній температурі.Кепірування здійснюють при завершенні із застосуванням суміші Ас2О/Ру при кімнатній температурі3Fmoc-L-Ala-OH10 хв та 20 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 2,0 АА/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DІEA, 2 год, кімнатна температура.4Fmoc-L-lle-OH10 хв та 20 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 2,0 АА/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2 год, кімнатна температура.і5Fmoc-L-Lys(Boc)-OH10 хв та 20 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 2,0 АА/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DІEA, 2 год, кімнатна температура.6Fmoc-L-Asp(tBu)-OH10 хв в та 20 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc,6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 2,0 АА/2,0 HOBt/2,0 TBTU/2,0 DIEA, 2 год, кімнатна температура. М'який режим гідролізу Препарат) 18: Зразок пептиду (42,13 г) па смоляному напівпродукті поміщають в колбу, і тричі обробляють 10 об'ємами (400 мл) 1 % розчину TFA у DCM протягом 10 хв кожного разу з подальшим промиванням DCM. Кожна обробку гасять додаванням 4,4 мл піридину. Одержані розчини об'єднують, і концентрують in vacua. Відновлення здійснюють етанолом (25 мл) з подальшим концентруванням насухо, і одержують 56,6 г піноподібної напівтвердої речовини. Воду об'ємом 400 мл додають 10 разів для одержання суспензії. Суспензію фільтрують, і промивають водою. Тверду речовину виділяють, і сушать у вакуумі при температурі 40 °C до постійної маси, і одержують 23,3 г Препарату 18 у вигляді порошку білого кольору. Синтез Препарату 17 (52S)-52-((((9Н-Флуорен-9-іл)метокси)карбоніл)аміно)-25-(трет-бутоксикарбоніл)-2,2-диметил-4,23,28,37,46-пентаоксо-3,32,35,41,44-пентаокса-24,29,38,47-тетраазатрипентаконтан-53-ова кислота Препарат 6 (80 г, 92 ммоль), DІEA (17,53 мл, 101 ммоль), TSTU (30,3 г, 101 ммоль) та ацетонітрил (1л) завантажують у посудину, та перемішують при температурі 23 °C протягом 17 год. Розчин концентрують, потім одержаний залишок помаранчевого кольору повторно розчиняють у ЕtOАС (1,6 л), після чого промивають 0,1 Μ HСІ (2×1 л). Органічний шар промивають водою (2×1 л), потім сушать над MgSO4, фільтрують, концентрують in vacuo, і одержують масло помаранчевого кольору (83 г). Другу партію одержують у тому ж масштабі, об'єднують, і одержують 123 г неочищеного масла. Проміжний складний ефір (123 г, 110 г активної речовини, 113 ммоль) розчиняють у EtOH (700 мл), потім додають Fmoc-лізин (45,9 г, 125 ммоль) і DIEA (21,70 мл, 125 ммоль), і реакційну суміш перемішують протягом 17 год. Після завершення реакції EtOH видаляють in vacua, і одержують масло помаранчевого кольору (201 г). Залишок розчиняють у ЕtOАс (1,1 л), і промивають спочатку 0,1 Μ розчином HСІ (3×400 мл), потім водним розчином NaHCO3 (400 мл). Шари розділяють, після чого органічний шар промивають насиченим водним розчином хлориду натрію (1×400 мл). Органічні речовини концентрують, і одержують масло помаранчевого кольору (×190 г). Долають ацетон (400 мл), після чого одержану суспензію фільтрують для видалення неорганічних речовин. Суміш концентрують, потім очищають із застосуванням нормально-фазової хроматографії (1,1 кг діоксиду кремнію, приготованого з сумішшю гептан/ацетон 60/40), і елююють елюентом зі зростаючою полярністю (збираючи /3 л фракцій). Фракції щонайменше 95 % площі ВЕРХ об'єднують, концентрують, і одержують густе масло жовтого кольору (70 г) Препарату 17. Синтез Препарату 19А Послідовність SЕQ ID NO: 18 Для синтезу застосовують Fmoc-Leu-OH-2-хлортритилову смолу з навантаженням 0,65 ммоль/г. Загальну процедуру SPPS застосовують з такими модифікаціями: ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPSРозчинник для сполучення: DМF1Fmoc-Aib-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.2Fmoc-L-Ile-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура.3Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АΑ/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.4Fmoc-L-Tyr(tBu)-ОH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.5Fmoc-L-Asp(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.6Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв Цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma4 год, кімнатна температура.7Fmoc-L-Thr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АΑ/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.8Fmoc-L-Phe-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.9Fmoc-Gly-Thr(FMе,MеPro)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура.10Fmoc-L-Glu(tBu)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.11Fmoc-Aib-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma18 год, кімнатна температура.12Boc-L-Tyr(tBu)-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура. Препарат 19А, одержаний з псевдопроліну, може бути підданий обробці до одержання сполуки Прикладу 3 у спосіб, аналогічний способу одержання Препарату 19В так, як описано в цьому описі. Синтез препарату 19В Послідовність SEQ ID NО: 19 Для синтезу застосовують Fmoc-Leu-OH-2-хлортритилову смолу з навантаженням 0,65 ммоль/г. Препарат 19В одержують із застосуванням процедури SPPS, по суті так, як описано в цьому описі. ЦиклАмінокислотаУмови проведення SPPSРозчинник для снолучення:DMFПримітки1Fmoc-Aib-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 8 год, кімнатна температура.2Fmoc-L-lle-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 18 год, кімнатна температура.3Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.4Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH3×30 хе цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/ 3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.5Fmoc-L-Asp(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.6Fmoc-L-Ser(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімната температура.7Fmoc-L-Thr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2, хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC 3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.8Fmoc-L-Phe-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.9Fmoc-L-Thr(tBu)-OH3×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи, 3,0 АА/3,3 DIC/3,0 Oxyma 4 год, кімнатна температура.10Boc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(tBu)-Gly-OH4×30 хв цикли відщеплення захисної групи Fmoc, 6×2 хв промивання після відщеплення захисної групи,1. 2,0 АА/2,2 DIC/2,0 Oxyma 6 год, кімнатна температура.2. повторне сполучення, 1,0 А А/1,1 РуВОР/2,5 DIPEA, 4 год, кімнатна температура.Кепірування здійснюють при завершенні із застосуванням суміші Ас2О/Ру М'який режим гідролізу Препарату 19В Препарат 19В одержують із застосуванням м'якою режиму гідролізу зв'язаного зі смолою Препарату·19В, по суті так, як описано в цьому описі, із застосуванням методів, відомих фахівцям. Дивись, наприклад, спосіб одержання Препарату 18. Одержану тверду речовину виділяють, і сушать у вакуумі при температурі 30-40 °C до постійної маси, і одержують 2,94 г продукту у вигляді порошку світло-жовтого кольору. Синтез Препарату 20 Послідовність SEQ ID NО: 20 До розчину Препарату 1 (4,25 г, 4,166 ммоль) та Препарату 16 (5,00 г, 3,340 ммоль) у DMSO/DMF (1:1, 200 мл) додають РуВОР (2,60 г, 5,00 ммоль) та DIЕA (1,75 мл, 10,0 ммоль) при температурі навколишнього середовища. Розчин перемішують протягом 18 год, а потім гасять додаванням надлишку діетиламіну (10,0 мл). Гашений розчин перемішують протягом 2 год, а потім повільно додають до насиченого водного розчину бікарбонат натрію/вона (1:1, 300 мл) при температурі 0 °C. Одержаний осад перемішують протягом 10 хв, а потім відфільтровують. Фільтрат послідовно промивають водою (3×150 мл), а потім метил-трет-бутиловим простим ефіром (3×150 мл). Тверду речовину сушать у вакуум і при температурі 40 °C, і одержують Препарат 20 у вигляді твердої речовини білого кольору (5,30 г, вихід 69 %, HRMS з обчисленням для С119Н169N21О24, очікуваний результат: 2276,2649, фактичний результат: 2276,2652). Послідовність SEQ ІD NО: 21 До розчину Препарату 20 (1,00 г, 0,44 ммоль) та Препарату 18 (0,90 г, 0,40 ммоль) у DMSO/DMF (1:1, 20 мл) додають РуВОР (314 мг, 0,30 ммоль) та DІEA (0,21 мл. 1,20 ммоль) при температурі навколишнього середовища. Розчин перемішують протягом 18 год, а потім гасять піперидином (0,79 мл, 4,00 ммоль). Гашений розчин перемішують протягом 2 год, потім охолоджують до температури 0 °C, і гасять розведеним розчином НСІ (50 мл). Одержану суспензію перемішують протягом 10 хв, і тверду речовину відфільтровують. Фільтрат послідовно промивають насиченим водним розчином бікарбонату натрію (2×50 мл), водою (3×50 мл), а потім метил-трет-бутиловим простим ефіром (3×50 мл). Тверду речовину сушать у вакуумі при температурі 40 °C протягом 18 год, і одержують Препарат 21 у вигляді твердої речовини білого кольору (1,80 г, вихід 106 %, НRMS з обчисленням для С225Н338N34О48, очікуваний результат: 4284,5053, фактичний результат: 4284,5062). Синтез Препарату 22 Послідовність SEQ ID NО: 22 До розчину Препарату 21 (214 мг, 0,05 ммоль) та Препарату 19В (116 мг, 0,055 ммоль) у DMSO/DMF (1:1, 3 мл) додають РуВОР (57 мг, 0,11 ммоль) та DIEA (58 мкл, 0,33 ммоль) при температурі навколишнього середовища. Розчин перемішують протягом 18 год, а потім гасять сумішшю 1:1 насиченою водною розчину бікарбонату натрію та води (10 мл). Одержану суспензію перемішують протягом 10 хв, і одержану тверду речовину відфільтровують. Тверду речовину промивають водою (3×10 мл), сушать у вакуумі при температурі 40 °C, і одержують Препарат 22 (285 мг, вихід 89 %, HRMS з обчисленням для С334Н512N48О74, очікуваний результат: 6379,7777, фактичний результат: 6379,7730). Приклад 3 Синтез сполуки Прикладу 3 Послідовність SEQ ID NO: 1 Розчин TFA (2,3 мл), води (0,1 мл), триізопропілсилану (0,1 мл) і DTT (75 мг) охолоджують до температури 0 °C. До цього розчину додають Препарат 22 (100 мг, 0,015 ммоль), реакційній суміші дозволяють нагріватися до температури навколишнього середовища, і перемішують протягом 2 год. Одержану суміш виливають у попередньо охолоджений (-20 °C) розчин метил-трет-бутилового простого ефіру (25 мл). Одержаний осад витримують при температурі -20 °C протягом 15 хв, а суспензію центрифугують, і промивають метил-трет-бутиловим простим ефіром (2×25 мл). Тверду речовину сушать у вакуумі при температурі 35 °C протягом 18 год, і одержують сполуку Прикладу 3 у вигляді твердої речовини білого кольору (71 мг, вихід 93 %, HRMS з обчисленням для С225Н348N46О68, очікуваний результат: 4810,5249, фактичний результат: 4810,5036). Етап 1: Вихідний розчин Препарату 25 (1,05 екв.) готують у 5 об'ємах DMSO/ACN (90:10 (у об'ємному відношенні)). Другий вихідний розчин Препарату 26 готують у 20 об'ємах DMSO/ACN (90:10 (у об'ємному відношенні)). Третій вихідний розчин готують з PyOxim (1,5 екв.) у 3 об'ємах ACN. Четвертий потік DIEA (4 екв) готують в ACN. Перші три потоки закачують в змішувач, на виході із змішувача приєднують DIEA, і суміш перекачують через інший змішувач і через реактор з поршневим потоком з 2 год перебування у ванні з постійною температурою 20 °C. На виході з реактора може бути додана оцтова кислота для витрачання залишкової кількості PyOxim (1-ціано-2-етокси-2-оксоетиліденаміноокси-трис-піролідинфосфонію гексафторфосфат). Через >2 год додають чистий діетиламін (10 екв), і перемішують через змішувач. Цей потік переходить у другий реактор з поршневим потоком з часом перебування 1 год у ванні з постійною температурою 20 °C. Розчин продукту Препарату 27 збирають, і направляють через нанофільтрацію з розчином DMSO/ACN 70/30 для видалення реагентів на 10-20 діаоб'ємів. Вихідний розчин Препарату 25 (2,40 кг, 96,7 % (мас.), 2,274 моль) готують шляхом розчинення твердої речовини в DMSO (13,88 кг, 12,62 л) і розведення розчину ACN (1,09 кг, 1,39 л), для одержання розчину Препарату 25 (114,3 мг/мл, 0,112 Μ) у суміші 90:10 DMSO:ACN (у об'ємному відношенні). Другий вихідний розчин Препарату 26 (послідовність SEQ ID NО: 26, 2,79 кг, 98,6 % (мас.), 1,836 моль) готують шляхом розчинення твердої речовини в DMSO (54,8 кг, 49,8 л) і розведення ACN (4,3 кг, 5,47 л) для одержання розчину Препарату 26 (45,5 мг/мл, 0,030 М) в суміші 90:10 DMSO:ACN (у об'ємному відношенні). Третій вихідний розчин готують з PyOxim (4,5 кг, 8,53 моль) в ACN (47,33 кг, 60,22 л), і одержують 0,132 Μ розчину. DІEA додають у вигляді чистої рідини. Потоки розчину Препарату 25 (14,91 л, 1,704 кг, 1,670 моль, 0,95 екв. 5,9 г/хв) та Препарату 26 (58,46 л, 2,660 кг, 1,750 моль, 1,00 екв, 22,5 г/хв) і PyOxim (1,4 екв, 5,4 г/хв) закачують у змішувач у поєднанні з чистим DIЕA (4,0 екв, 0,446 мл/хв) при температурі 20 °C. Суміш перекачують через інший змішувач та через реактор з поршневим потоком з 3-годинним часом перебування у ванні з температурою 20 °C. збирають протягом 42,9 год, і одержують 88,6 кг розчину продукту. Нанофільтрація являє собою процес фільтрації на мембранній основі, який застосовують для розділення хімічних сполук на основі їх величини та різниці молекулярних мас. Розчин продукту Препарату 27 містить реагенти (діетиламін, PyOxim, DІEA та ін.) та небажані побічні продукти (наприклад, дибензофульвен), які бажано видалити перед переходом до наступного етапу. Нанофільтрацію застосовують для видалення небажаних сполук (молекулярна маса <500 Да). Розчин продукту Препарату 27 завантажують в нанофільтраційний живильний резервуар, і прокачують по рециркуляційному контуру через теплообмінник та блок нанофільтрації, що включає в себе відповідну мембрану (керамічну або полімерну), для спричинення бажаного розділення. Небажані сполуки виводяться в перміат, і збираються окремо або видаляються у відходи. Для підтримання постійного об'єму в нанофільтраційному резервуарі, в нього постійно закачують свіжий розчинник, тобто 70:30 (у об'ємному відношенні) DMSO/ACN, у відповідності з відкачуваним об'ємом розчиненої речовини. Розчин продукту Препарату 27, очищений із застосуванням нанофільтрації, спрямовується безпосередньо на Етап 2. Розчин (88,6 кг) Препарату 27 з відщепленою захисною Fmoc-групою у DMSO/ACN та діетиламін (1,34 кг) подають в реактор. Суміш перемішують при температурі 20 °C протягом 2 год, і одержують Препарату 27 (87,6 л, 38,45 мг/мл, 3,37 кг, 1,48 моль). Розчин продукту Препарату 27 завантажується в нанофільтраційний живильний резервуар, і прокачується по рециркуляційному контуру через теплообмінник та блок нанофільтрації, який включає в себе відповідну мембрану (керамічну або полімерну), для спричинення бажаного розділення. Небажані сполуки виводяться в перміат, і збираються окремо або видаляються у відходи. Операцію продовжують до досягнення достатнього видалення небажаних домішок. Для підтримання постійного об'єму в нанофільтраційному резервуарі, в нього постійно закачують свіжий розчинник (70:30 (у об'ємному відношенні) DMSO/ACN) у відповідності з відкачуваним об'ємом розчиненої речовини. В результаті одержують Препарат 27 у DMSO/AGN (72,4 л, 40,8 мг/мл, 2,95 кг, 1,30 моль, вихід 78,1 % упродовж сполучення, відщеплення захисної групи групи Fmoc та нанофільтрації). Пояснювальний приклад Етапу 1 - Аналітичні результати. ВЕРХ підтверджує перетворення Препарату 25 та Препарату 26 з утворенням Препарату 27. В цій методиці аналізу застосовують колонку з фенілгекеидьною стаціонарною фазою при температурі 65 °C (2,1 мм (внутрішній діаметр)а150 мм11,7 мікрона (розмір частинок)) з градієнтом В (0,1 % розчин TFA у воді та ацетонітрилі) 2-98 % протягом 12 хв. Для цього матеріалу застосовують УФ-детектування при 214 нм. У таблиці А.1 наведені дані мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю, зібрані для продукту реакції сполучення на Етапі 1 (Fmoc-захищений Препарат 27), і продукту реакції відщеплення захисної групи Fmoc Етапу 1 (Препарат 27). Точність маси являє собою показник, що використовується для підтвердження відповідності сполуки, яку визначають, прогнозованій сполуці. Таблиця А.1Підтвердження визначених Fmoc-захищеного Препарату 27 і Препарату 27 завдяки точності маси, обчисленої за допомогою даних мас-спектрометрії з високою роздільною здатністюСполукаХімічна формулаТеоретична моноізотопна маса (нейтральна)Спостережуваний m/z іонівСтан зарядуОбчислена моноізотопна маса (нейтральна)Точність маси (млн-1)Fmoc-захищений Препарат 27С134Н179N21О262498,3332499,340212498.33290,05Препарат 27С119Н169N21О242276,26492277,27432276,2670,9 Етап 2 Схема А.2, Синтез Препарату 29 (послідовність SEQ ID NO: 29) з фрагментів Препарату 27 (послідовність SEQ ID NО: 27) та Препарату 28 (послідовність SEQ ID NО: 28). Етап 2 Хімічна взаємодія на Етапі 2 Етап 2: Вихідний розчин Препарату 28 (1,15 екв) готують у 10 об'ємах DMSO/ACN (90:10 (у об'ємному відношенні). Другий вихідний розчин готують з PyOxim (2 екв) в 1 об'ємі ACN. Готують третій потік DIEA (3 екв) в ACN (5 % (мас.) розчину). Розчин Препарату 27 з Етапу 1 і потоки Препарату 28 та PyOxim закачують у змішувач, на виході зі змішувача долають DIEA, і суміш перекачують через інший змішувач та через реактор з поршневим потоком з 2-годинним часом перебування у ванні і температурою 20 °C. На виході з редактора може бути додана оцтова кислота для витрачання залишкової кількості PyOxim. Через >2 год додають чистий діетиламін (10 екв), і перемішують через змішувач. Цей потік переходить у другий реактор з поршневим потоком з часом перебування 1 год у ванні з постійною температурою 20 °C. Розчин продукту Препарату 29 збирають, і направляють через нанофільтрацію із застосуванням розчину у DMF для видалення реагентів на 10-20 діаоб'ємів. Вихідний розчин Препарату 28 (4,68 кг, 98,9 % (мас.), 2,058 моль) готують шляхом розчинення твердої речовини в DMSO (41,75 кг, 37,95 л) і розведення розчину ACN (3,3 кг, 4,20 л) для одержання розчину Препарату 28 (94,7 мг/мл, 0,0421 М) у 90:10 DMSO:ACN (у об'ємному відношенні). Другий вихідний розчин готують з PyOxim (3,0 кг, 5,69 моль) в ACN (11,81 кг, 15,03 л), і одержують 0,327 Μ розчину, DІEA додають у вигляді чистої рідини. Потоки розчину Препарату 27 з Етапу 1 (73,86 л, 41,2 мг/мл, 3,04 кг, 1,336 моль, 0,0181 М, 1,0 екв. 29,9 г/хв) та Препарату 28 (1,3 екв. 17,7 г/хв) і PyOxim (2,1 екв. 2,9 г/хв) закачують у змішувач, на виході зі змішувача температуру доводять до 20 °C, і розчин поєднують з чистим DІEA (4,0 екв, 0,3744 мл/хв) при температурі 20 °C. Суміш перекачують через інший змішувач та через реактор і поршневим потоком з 3-годинним часом перебування у ванні з температурою 20 °C, збирають протягом 43,2 год, і одержують 129,35 кг розчину продукту Препарат) 29. Процес нанофільтрації здійснюють по суті так, як описано вищє в цьому описі, із застосуванням розчину продукту Препарату 29 замість розчину продукту Препарату 27. Процес нанофільтряції з використанням Fmoc-захищеного розчину Препарату 29 в DMSO/ACN здійснюють по суті так. як описано в цьому описі. Fmoc-захищений Препарат 29 (129,35 кг) та діетиламін (2,0 кг) додають в реактор для нанофільтрації. Процес нанофільтрації, призводить до одержання розчину Препарату 29 у DMF (98,85 л, 42,24 мг/мл, 4,18 кг, 0,974 моль, вихід 73,1 % упродовж сполучення, відщеплення захисної групи Fmoc та нанофільтрації). ВЕРХ підтверджує синтез Препарату 29 з Препарату 28 і Препарату 27. В цьому методі дослідження застосовують колонку С4 зі стаціонарною фазою при температурі 65 °C (2,1 мм (внутрішній діаметр)В150 мм11,7 мікрона (розмір частинок)) з градієнтом В (0,1 % розчин TFA у воді та ацетонітрилі) 25-98 % протягом 12 хв. Для цього матеріалу застосовують УФ-детектування при 214 нм. В таблиці A.3 наведені дані мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю, зібрані для продукту реакції сполучення на Етапі 2 (Fmoc-захищений Препарат 29), і продукту реакції відщеплення захисної групи Етапу 2 (Препарат 29). Точність маси підтверджує моноізотопну масу нейтральних форм визначених продуктів. Таблиця А.3Підтвердження визначених Fmoc-захищеного Препарату 29 і Препарату 29 завдяки точності маси, обчисленої із застосуванням даних мас-спектрометрії з високою роздільною здатністюСполукаХімічна формулаТеоретична момоізотопна маса (нейтральна)Спостережуваний m/z іонівСтан зарядуОбчислена моноізотопна маса (нейтральна)Точність маси (млн-1)Fmoc-захищений Препарат 29С240Н348N34О504506,57342254,29424506,57350,02Препарат 29С225Н338N34О484284,50532143,25964284,50460,17 Етап 3 Схема А.3. Синтез Препарату 31 (послідовність SEQ ID NO: 31) з фрагментів Препарату 30 (послідовність SEQ ID NO: 30) та Препарату 29 (послідовність SEQ ID NO: 29). Етап 3 Опис періодичною процес): До підданого нанофільтруванню розчину Препарату 29 (2,249 г, 46,5 мг/г, 104,6 мг, 0,0244 ммоль) у DMF та Препарату 30 (71,5 мг, 90,6 % площі, 0,0306 ммоль) у DMF (0,3068 г, 0,325 мл) при температурі -5 °C додають 5,0 % (мас.) розчину DІEA в DMF (114,0 мг, 5,70 мг DIEA, 0,0441 ммоль, 1,8 екв) і 10,1 % (мас.) розчину (1-[біс(диметиламіно)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло(4,5-b]піридинію 3-оксидгексафторфосфату (HATU) в DMF (154,9 мг, 15,59 мг HATU, 0,0410 ммоль, 1,7 екв). Розчин перемішують протягом 4 год при температурі -5 °C, а потім гасять 5 % (мас.) водним розчином бікарбонат) натрію (5,295 г, 4,8 мл) при температурі навколишнього середовища, який додають протягом 15 хв. Одержану суспензію перемішують при температурі 0 °C протягом 15 хв, і одержану тверду речовину відфільтровують. Тверду речовину промивають спочатку водою (4×2 мл), а потім МТВЕ (4×2 мл). Клейку тверду речовину сушать у вакуумі при температурі 35 °C, і одержують Препарат 31 (219,7 мг, 47,6 % площі, 0,0164 ммоль, вихід 67,1 %). Вихідним розчин Препарату 30 готують у 10 об'ємах DMF. Другий вихідний розчин HATU (1,8 екв) готують в 10 % (мас.) розчину ACN. Готують третій потік DIEA (2,5 екв) у DMF (5 % (мас.) розчин). Потік розчину Препарату 29 з Етапу 2 і потік Препарату 30 та DIEA закачують у змішувач, на виході зі змішувача потік охолоджують, і об'єднують з охолодженим розчином HATU. Суміш перекачують через інший змішувач та через реактор з поршневим потоком з 3-годинним часом перебування у ванні з постійною температурою -5 °C, і збирають. Готують розчин розсол/бікарбонат (водний розчин 17 % (мас.) водною розчину хлориду натрію, 0,5 % (мас.) водного розчину бікарбонату натрію) з 19 % (мас.) сольовим навантаженням. Потім розчин продукту Препарату 31 у DMF перекачують в реактор з перемішуванням суспензії і відбором змішаного продукту (MSMPR) разом із сольовим розчином для утворення осаду. Тау в реакторі з перемішуванням суспензії і відбором змішаного продукту становить 1 год. Другий MSMPR працює при більш низькій температурі для тау=1 год, і цю суспензію подають на фільтр періодично. Суспензію промивають водою, і сушать під вакуумом при температурі 35 °C. Вихідний розчин Препарату 30 (9,42 кг, 83,6 % (мас.), 3,72 моль) готують у DMF (54,12кг), і одержують 0,0563 Μ вихідного розчину. Другий вихідний розчин HATU (1,15 кг, 3,02 моль) готують у ACN (10,4 кг), і одержують 0,215 Μ вихідного розчину. DIEA додають у вигляді чистої рідини. Потоки розчину Препарату 29 з Етапу 2 (98,85 л, 42,24 мг/мл, 4,18 кг, 0,975 моль, 0,0099 М, 1,0 екв, 40,2 г/хв). Препарату 30 (1,3 екв, 9,2 г/хв) та DIEA (2,1 екв, 0,152 мл/хв) закачують у змішувач. На виході зі змішувача потік охолоджують до температури 0 °C, і об'єднують з охолодженим розчином HATU (2,0 екв, 3,2 г/хв) при температурі 0 °C. Суміш перекачують через інший змішувач та через реактор з поршневим потоком з 4-годинним часом перебування у ванні з температурою 0 °C, збирають протягом 42 год, і одержують 131,8 кг розчину продукту. Розчин продукту осаджують у два статі. Розчин 17 % (мас.) водного розчину NaCl/0,5 % (мас.) водного розчину NaHCО3 (29 кг) об'єднують з DMF (13,2 кг) в реакторі з інертною атмосферою, та охолоджують до температури, не нижчої ніж 20 °C. Потім розчин продукту в DMF (66,6 кг) протягом 1 год додають в реактор з 17 % (мас.) водного розчину NaCI/0,5 % (мас.) водного розчину NaHCО3 (34,4 кг), підтримуючи температуру 20 °C, що призводить до осадження продукту Препарату 31. Суспензію охолоджують до температури 5 °C протягом 1 год, перш ніж додавати воду (загалом 32,2 кг) двома порціями. Суспензію (5 °C), перш ніж її фільтрувати, перемішують протягом 0,5 год. Вологий відфільтрований осад повторно суспендують у воді (63,9 кг) протягом 0,5 год, і фільтрують. Другу частину розчину продукту осаджують аналогічним чином. Розчин 17 % (мас.) водного розчину NaCl/0,5 % (мас.) водного розчину NaHCО3 (29 кг) і DMF (13,55 кг) об'єднують в реакторі, і охолоджують до температури, не нижчої за 20 °C. Другу частину розчину продукту в DMF (65,2 кг) протягом 1 год. додають до реактора з 17 % (мас.) водною розчину NaCI/0,5 % (мас.) водного розчину NaHCО3 (36,8 кг), підтримуючи температуру 20 °C, що призводить до осадження продукту Препарату 31. Суспензію охолоджують до температури 5 °C протягом 1,25 год, перш ніж додавати воду (32,1 кг загалом) двома порціями. Суспензію, перш ніж її фільтрувати поверх першого вологого відфільтрованого осаду, перемішують протягом 0,5 год. Об'єднаний вологий відфільтрований осад повторно двічі суспендують у воді (64 кг кожного разу) протягом 0,5 год. кожного разу, і фільтрують. Далі слідують дві витіснювальні промивки водою (64 кг кожна). Об'єднаний промитий вологий відфільтрований осад продувають N2, після чого сушать під вакуумом при температурі 38 °C до досягнення вмісту вологи за визначенням за методом Карла Фішера <4 % (мас.), і одержують Препарат 31 (10,34 кг, передбачувана 60 % активність, 0,972 моль, передбачуваний 100 % вихід). Πриклад 3 Тирзепатид (послідовність SEQ ID NО: 1) Розчин TFA (2,3 мл), води (0,1 мл), триізопропілсилану (TIPS, 0,1 мл) та дитіотреїтолу (DTT, 75 мг) охолоджують до температури 0 °C. До цього розчину додають Препарат 31 (100 мг, 0,015 ммоль), реакційній суміші дозволяють нагрітися до температури навколишньою середовища, і перемішують протягом 2 год. Одержану суміш виливають у попередньо охолоджений (-20 °C) розчин МТВЕ (25 мл). Одержаний осад витримують протягом 15 хв при температурі -20 °C, після чого суспензію центрифугують, і промивають МТВЕ (225 мл). Тверду речовину сушать у вакуумі при температурі 35 °C протягом 18 год, і одержують сполуку Прикладу 3 у вигляді твердої речовини білого кольору (71 мг, вихід 93 %, HRMS з обчисленням для C225H348N46O68, очікуваний результат: 4810,5249, фактичний результат: 4810,5036. В реактор з інертною атмосферою при температурі 15 °C поміщають DCM (27,3 кг, 20,6 л), воду (4,1 кг), Препарат 31 (10,34 кг, передбачувана 60 % активність, 0,972 моль) і DTT (3.10 кг). В окремий реактор з інертною атмосферою помішають TFA (154,1 кг, 103,4 л) і TIPS (3,2 кг, 4,2). Через 0,25 год до суспензії Препарату 31, DCM, води та DTT додають розчин TFA/TIPS, і одержують безбарвний розчин, який нагрівають та витримують при температурі 20 °C протягом 3 год. Після 3 год при температурі 20 °C реактор охолоджують до температури -10 °C. В окремий реактор поміщають МТВЕ (382,4 кг, 516,8 л), охолоджений до температури -20 °C. Частину цього холодного МТВЕ (91,8кг, 124,1 л) додають до холодного реакційного розчину протягом 2 год, підтримуючи температуру від -5 °C до -18 °C. Залишок холодного МТВЕ (294,3 кг, 397,7 л) додають протягом 1,5 год, підтримуючи температуру від -5 °C до -18 °C, що призводить до осадження сполуки Прикладу 3. Температуру суспензії доводять до 0 °C, і витримують протягом >0,5 год перед її фільтруванням трьома частинами. Комбінований вологий відфільтрований осад повторно двічі ресуспендують МТВЕ (114,7 кг, 155 л), і фільтрують перед остаточним витіснювальним промиванням МТВЕ (114,7 кг, 155 л). Вологий відфільтрований осад сушать при температурі 28 °C до визначення <4,5 % (мас.) МТВЕ. В результаті цього одержують сполуку Прикладу 3 (7,77 кг, 46,8 % (мас.), 0,755 моль, вихід 77,7 %). Приклад 4А (лінійний SPPS) Тирзепатид (послідовність SEQ ID NO: 1) В реактор завантажують Fmoc-смолу Зібера (17 кг, 0,76 ммоль/г). Смола набухає у DMF, її перемішують протягом 2 год, потім DMF відфільтровують зі смоли. Після цього смолу загалом двічі промивають DMF. Потім Fmoc-захищену смолу піддають відщепленню захисної Fmoc-групи із застосуванням обробки 20 % PІP/NMP. Відбір проб для перевірки видалення Fmoc проводять після останньої обробки PIP/NMP для підтвердження >99 % видалення Fmoc із застосуванням УФ дослідження (ІРС-мішень залишається <1 % Fmoc). Після остаточної обробки 20 % (у масовому відношенні) PIP/NMP шар смоли багаторазово промивають DMF. Потім будують пептидний каркас із застосуванням наведених нижче загальних умов для кожного сполучення амінокислот та кожного відщеплення захисної групи амінокислоти: Етап процесуРозчинник/РеагентОб'ємЕквівалентністьВідщеплення захисної групи Fmoc20 % (у об’ємному відношенні) піперидину/NMP9 мл/г смолиПромивання після відщеплення захисної групиDMF9 мл/г смолиСполучний реакційнийNMP7.25 мл/г смолиАмінокислота3,0 еквівалентиЧистий Oxyma3,0 еквівалентиDIC3,3 еквівалентиПромивання після сполученняDMF9 мл/г смолиВидалення ivDde8 % гідразин/DMF9 мл/г смолиПромивання після видалення ivDdeDMF9 мл/г смолиПромивання для видалення набухання після складанняΙΡА1,8 мл/г смоли Відщеплення захисної групи Fmoc-групи: Смолу в реакторі для синтезу пептидів обробляють трьома або чотирма порціями 20 % (в об'ємному відношенні) розчину PIP/NMP. Смолу при кожній обробці перемішують протягом 30 хв з подальшим фільтруванням для завершення видалення відщеплюваної захисної групи Fmoc. Після остаточної обробки 20 % (в об'ємному відношенні) розчином PIP/NMP шар смоли промивають мінімум шість разів DMF при попередньо визначеному об'ємі порції DMF. Активація амінокислот: В реактор завантажують заздалегідь підготовлений 12 % (у масовому відношенні) розчин Oxyma Pure/NMP. Потім додають вибрану Fmoc-амінокислоту. Суміш перемішують при температурі 20±5 °C до повного розчинення Fmoc-амінокислоти. Потім розчини Fmoc-амінокислота/Oxyma Pure/NMP охолоджують до температури 15±3 °C перед активацією для забезпечення регулювання незначної реакції екзотермічної активації, і температуру одержаного розчину підтримують в діапазоні 20±5 °C. Потім розчин амінокислоти активують додаванням DIC. Після цього активований розчин складного ефіру перемішують протягом 20-30 хв перед перенесенням розчину в реактор, в який поміщений пептид на смоляному напівпродукті. Сполучення: Після завершення етапу попередньої активації розчин активованого складного ефіру переносять в реактор, що містить депротектований пептид на смолі, для ініціювання реакції сполучення. Реакційну суміш пептидною сполучення перемішують при температурі 20±5 °C протягом щонайменше 4 год. Після необхідного часу перемішування відбирають пробу смоли для визначення завершення сполучення (ІРС). Відбирання проб повторюють через певні проміжки часу, доки не буде отриманий прохідний результат ІРС. За необхідності виконуються операції повторного сполучення. Після завершення сполучення, вміст розчину реактора для синтезу пептидів фільтрують, після чого пептиди на смоляних напівпродуктах декілька разів промивають DMF для підготовки до наступного сполучення. Сполучення Ilе (12) з Aib (13): Сполучення Fmoc-Ilе (12) з Aib (13) виконується із застосуванням симетричного ангідридного підходу з використанням шести еквівалентів Fmoc-AA, трьох еквівалентів DIC. Час активації для цієї послідовності подовжується до 40-60 хв. щоб забезпечити утворення активованих симетричних ангідридів. Для досягнення завершення реакції (<1% несполучених), як визначається із застосуванням ВЕРХ-аналізу, необхідним с тривалий час перемішування сполучної реакційної суміші (18 год.). Відщеплення захисної групи Lys (20) ivDde (Препарат 23): Здійснюють селективне відщеплення захисної групи Lys (20) ivDde з 39 амінокислот, повністю захищеної на пептидному каркасі Boc-Tyr(1)-Ser(39). Відщеплення захисної групи здійснюють із застосуванням 8 % (у масовому відношенні) розчину гідрату гідразину в DMF при перемішуванні протягом 4 год при температурі навколишньою середовища. Реакцію відщеплення захисної групи контролюють із застосуванням ВЕРХ, орієнтуючись на межу ІРС<1 % компонента Lys(ivDde), що залишається після відщеплення захисної групи. Одержаний пептидний фрагмент (Препарат 23) повторно промивають (8 разів) DMF для повного видалення залишкового гідразину. Повністю побудований фрагмент Препарату 23 чотири рази промивають ІРА, потім сушать при температурі <40 °C до досягнення LOD<1 %). Препарат 23 упаковують, і зберігають у холоді (-20 °C) перед сполучення з Препаратом 6. Сполучення Препарату 6 з Препаратом 23: Тверді речовини Препарату 6 (1,5 екв) та РуВОР (1,5 екв) поміщають в реактор, після чого додають DMF, і суміш перемішують до розчинення. Після цього завантажують коллідин для ініціювання утворення активних складних ефірів. Розчин активованого складного ефіру перемішують протягом 60 хв перед перенесенням в реактор, у який поміщений напівпродукт Препарату 23. Реакційну суспензію перемішують протягом 18 год при температурі 25 °C. Пробу суспензії відбирають для визначення завершення сполучення (ІРС), і, за необхідності, відбір проби повторюють через певні проміжки часу, необхідні для визначення проходження ІРС (<1 % Препарату 23). Після завершення сполучення вміст розчину відфільтровують у відходи. Повністю побудований напівпродукт Препарату 24 промивають декілька разів DMF, потім ІРА. Препарат 24 сушать при температурі ч40 °C до досягнення LOD 41 %. Препарат 24 упаковується, і зберігається в холоді (-20 °C) перед відщепленням від смоли. Розщеплення смоли та виділення неочищеної сполуки Прикладу 4А. Готують коктейль для розщеплення, то складається з трифтороцтової кислоти (TFA), триізопропілсилану (TIPS), дитіотреїтолу (DTT), DCM та води. Коктейль для розщеплення охолоджують до температури 15±5 °C. Кількість реагентів показана в наведеній нижче таблиці: Етап процесуРозчинник/РеагентОб'єм (завантажений, зв'язаний зі смолою)Коктейль для розщепленняTFA7,16 мл/гВода0,34 мл/гTIPS0,24 мл/гDTT0,24 г/гDCM0,75 мл/гПовна завантажена кількість коктейлюДані відсутні8,50 мл/гПромивання відпрацьованої смолиDCM3 мл/гАнтирозчинникМТВЕ14 г/гПромивання посудини і відфільтрованого осадуМТВЕ3 г/г В реактор поміщають спочатку Препарат 24, а потім коктейль для розщеплення. Суміш перемішують, і витримують при температурі 23 °C протягом 3 год. Суміш фільтрують, потім відпрацьовану смолу промивають DCM Промивний фільтрат DCM об'єднують з основним об'ємом розчину для відщеплення захисної групи, і вміст охолоджують до температури и-10 °C. МТВЕ охолоджують до температури --13 °C. Потім холодний МТВЕ подається до холодного фільтрату двома порціями. Швидкість подачі МТВЕ регулюється для підтримання внутрішньої температури неочищеного розчину на рівні в5 °C. Початкова кількість МТВЕ становить 545 % від загальної кількості МТВЕ. Незадовго до кінця додавання МТВЕ утворюється м'який осад, але він легко повторно розчиняється в розчині. Розчин з осадом повторно охолоджують до внутрішньої температури -15±5 °C. Друге додавання МТВЕ здійснюють зі швидкістю, яка приблизно в 5-10 разів перевищує початкову швидкість подачі МТВЕ, і складає 555 % від загальної кількості МТВЕ. Внутрішня температура суспензії з осадами під час додавання підтримується на рівні 50 °C. Одержану суспензію витримують при температурі -8±3 °C протягом мінімум 6 год, після чого нагрівають до температура 0±3 °C, і додатково витримують протягом 2 год перед виділенням. Холодну неочищену пептидну суспензію фільтрують, після чого одержаний полений відфільтрований осад промивають МТВЕ. Потім неочищений вологий відфільтрований осад сполуки Приклад 4А сушать до ІРС-цільового значення LOD<1 %. Неочищений продукт, сполуку Прикладу 4 упаковують, та зберігають. Неочищений напівпродукт зберігають у холоді (-20 °C) до очищення. Загалом, одержують 45,39 кг неочищеної сполуки Прикладу 4А із 45 % (мас.) та 64 % площі піка чистоти ВЕРХ. Вихід на основі смоли Зібера становить 47 %. Очищення сполуки Прикладу 4А: Рухомі фази: Рухома фаза А (МРА) 90 % води, 0,1 % TFA та 10 % ACN Рухома фаза В (МРВ) 10 % води, 0,1 % TFA та 90 % ACN Очищення 1 (RP1) із застосуванням хроматографії з оберненою фазою: Неочищену сполуку Прикладу 4А розчиняють у 90 % (мас.) МРА та 10 % (мас.) МРВ. Розчин перемішують протягом щонайменше 7 год для завершення декарбоксилювання триптофану. Витриманий неочищений розчин фільтрують, і завантажують на попередньо врівноважень колонку Kromasil 100-10-C8. Колонку промивають сумішшю буферів А (90 % води, 0,1 % TFA і 10 % ACN) та В (10 % води, 0,1 % TFA та 90 % ACN), що дає 30 % ACN для двох об'ємів колонки, підготовлених до елюювання шляхом збільшення змішаної концентрації ACN з 30 % до 35 % на один об'єм колонки. Тирзепатид елююють з колонки із застосуванням 1,5 % збільшення ACN на об'єм колонки до завершення елюювання. Елюент фракціонують, і аналізують на чистоту із застосуванням RP-HPLC (високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою). Колонку регенерують, збільшуючи ACN з 47 % до 65 % на один об'єм колонки, і продовжують подавати 65 % ACN для трьох об'ємів колонки. Колонку повторно врівноважують, із застосуванням 30 % ACN для двох об'ємів колонки перед наступною послідовністю введень. Фракції, які відповідають вимогам включення до загального потоку, об'єднують. Фракції, які не відповідають критеріям чистоти, але мають чистої) понад 50 %. Можуть бути об'єднані для повторних введень після завершення всіх початкових введень. Фракції для повторних введень поділяють на фракції переднього і задньою фронту хроматографічної зони, розводять буфером А, і зберігають у холоді. Фракції для повторних введень обробляють, та об'єднують із застосуванням критеріїв початкового введення; однак лише фракції головних піків піддають прямій обробці, і подальше введення не здійснюють. Після завершення об'єднання в головний потік, напівпродукт аналізують на концентрацію та чистоту. Перед обробкою RP2 матеріал розбавляють, і доводять рH до 8. Процес RPI дас 37 кг неочищеного продукту та 14277 г продукту, який входив до його складу·, а середньою чистотою пулу 90,9 %. Очищення 2 (RP2) із застосуванням хроматографії з оберненою фазою: Розчин RP1 сполуки Прикладу 4A RPI завантажують на попередньо врівноважену наповнену колонку Kromasil 100-10-C8. Колонку промивають сумішшю буфера С (90 % водний розчин NH4OAc, pH 8,0, 10 % ACN) і буфера D (10 % водний розчин NH4OAc, pH 8,0, 90 % ACN), що призводить до одержання 20 % розчину ACN для двох об'ємів колонки. Тирзепатид елююють і колонки із застосуванням 3,5 % збільшення ACN на колонку до завершення елюювання. Елюенти фракціонують, і аналізують на чистоту із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою. Після елюювання колонку регенерують, збільшуючи ACN до 80 % на один об'єм колонки, і продовжують подавати 80 % ACN для трьох об'ємів колонки. Колонку повторно врівноважують, із застосуванням 20 % ACN для двох об'ємів колонки перед наступною послідовністю введень. Фракції, які відповідають вимогам включення до загального потоку, об'єднують. Фракції, які не відповідають критеріям чистоти, але мають чистота понад 60 %. можуть бути об'єднані для повторних введень після завершення всіх початкових введень. Фракції для повторних введень поділяють на фракції передньою і задньою фронту хроматографічної зони, розводять буфером С, і зберігають у холоді. Фракції для повторних введень обробляють та об'єднують із застосуванням критеріїв початкового введення: однак лише фракції головних піків піддають прямій обробці, і подальше введення не проводиться. Після завершення об'єднання в головний потік, напівпродукт аналізують на концентрацію га чистоту. Перед підготовкою до етапу TFF pH матеріалу доводять до 8. Процес RP2, розпочинаючи з 14,2 кг, дає 10,9 кг продукту, який входив до його складу, з виходом 76,7 %. Іонообмінна хроматографія (ІЕХ): Розчин RP2 сполуки Прикладу 4А фільтрують, і завантажують у колонку Amberchrom CG 300M. Дві фракції елююють із застосуванням рухомої фази Ε (10 % водний розчин ацетату амонію, 5 % ІРА, рН 8) та рухомої фази F (ізопропанол). Фракції аналізують на вміст пептидів, і фракції <3 мг/мл викидають. Об'єднаний концентрат фракцій зберігають при температурі 20 °C перед осадженням. Процес ІЕХ починається з 10,9 кг RP2, і одержують 14,3 кг матеріалу сполуки Прикладу 4А з 97,8 % чистотою пулу. Осадження: Розчин ІЕХ сполуки Прикладу 4А (333 кг) фільтрують, а потім завантажують ізопропанол (850 л) для зменшення вмісту води до <10 % (мас.). Розведений розчин охолоджують до температури 0±3 °C під час підготовки до завантаження МТВЕ та осадження. МТВЕ (2304 л, 1708 кг) охолоджують до температури 0±3 °C. Холодний МТВЕ подають до розчину ІЕХ зі швидкістю и0,69 кг/хв впродовж перших /37 % завантаження МТВЕ. Потім швидкість подачі збільшують в середньому до 32,3 кг/хв для завершення залишкових /63 % завантаження МТВЕ. Температура під час подачі підтримується на рівні <5 °C. Одержану суспензію осаду фільтрують у холодному стані (<10 °C). після чого відфільтрований осад проминають МТВЕ. Відфільтрований осад висушують до LOD<2 %. Зволоження сполуки Прикладу 4А: Сполуку Прикладу 4А зволожують шляхом пропускання вологого азоту крізь фільтр-осушник. Вологість вихідною потоку газу на виході фільтра перевіряють кожні 60 хв. Зволоження продовжують до тих пір, поки у вологому відфільтрованому осаді не залишиться <0,5 % МТВЕ та <0,2 % ІРА. Після завершення процесу зволоження потік азоту перемикають на протікання сухого азоту через відфільтрований осад чистого продукту Прикладу 4А. Матеріал відбирають для виявлення води та залишкових кількостей розчинників, порівняно з конкретними показниками ІРС. і сушіння із застосуванням сухого азоту продовжують до досягнення бажаного цільового вмісту води 5-7 % (у масовому відношенні). Загалом виділяють 12,9 кг сполуки Прикладу 4А з чистотою за вмістом пептидів >95 %. Загальний вихід за загрузкою смоли Зібера становить 31 %. Приклад 4В (Лінійний SPPS) Тирзепатид (послідовність SEQ ID NO: 1) Препарат 23 Спосіб одержання Препарату 23 по суті такий, як викладено у Прикладі 4А, за винятком того, що NMP повністю замінюють на DMF для всіх реакцій сполучення та відщеплення захисної групи. Крім того, стехіометричне співвідношення амінокислота:Oxyma до DIC знижується до 2,5:2,5:2,7 молярних еквівалентів, беручи за основу смолу Зібера. Єдиним винятком, пов'язаним із використанням DMF, є сполучення Ile 12-Aib 13, де зберігається NMP. У ньому прикладі 17,6 кг смоли Зібера обробляють до 92,2 кг пептиду Препарату 23 на смоляному напівпродукті. Препарат 24 За способом по суті таким, як описано у Прикладі 4А, одержують 92,1 кг Препарату 23; і далі обробляють до 97,3 кг пептиду Препарату 24 на смоляному напівпродукті. Препарат 24 упаковують, і зберігають в холоді (-20 °C) перед відщепленням від смоли. Розщеплення смоли та виділення неочищеної сполуки Прикладу 4В: Дві партії Препарату 24 у кількості 32 кілограми обробляють із застосуванням умов по суті таких, як описано в Прикладі 4А, для одержання 24,4 кг сполуки Прикладу 4В, з чистотою (за даними ВЕРХ) 69,5 % та виходом 52,6 %, та 21,3 кг сполуки Прикладу 4В, з чистотою (за даними ВЕРХ) 88,3 % та виходом 45,2 %. Неочищений напівпродукт зберігають у холоді (-20 °C) до очищення. Очищення сполуки Прикладу 4В: Розчинення неочищеної сполуки: Неочищений тирзепатид Прикладу 4В поміщають у посудину для розчинення, і розчиняють у розчині ацетонітрил:вода (1:1) до кінцевої концентрації 25 г твердої речовини/л розчину, рН одержаного розчину доводять до 8,5-9,5 із застосуванням гідроксиду амонію для ініціювання перетворення депсіпептидних ізомерів (10-15 %) на тирзепатид Прикладу 4В. Суміш з відрегульованим рН перемішують протягом щонайменше однієї години для забезпечення перетворення депсіпентиду. Потім рН доводять до 1,5-2,5 додаванням трифтороцтової кислоти, і розбавляють до 30 % вмісту ацетонітрилу під час підготовки до хроматографії. В цілому, неочищений розчин перемішують протягом щонайменше 7 год для перетворення солі Trp СО2 на тирзепатид Прикладу 4В. Перетворення тирзепатиду (TZP) на депсіпептид: Перетворення депсіпептиду на АРІ: Очищення 1 із застосуванням хроматографії з оберненою фазою (RP1): Процес RP1 по суті такий, як представлено в прикладі 4А. може бути застосований для перетворення депсіпептиду на АРІ. Процес очищення RP1 по суті такий, як описаний у Прикладі 4А; однак описаний вище етап розчинення неочищеного продукту покращує можливості хроматографічного етапу RP1. Це забезпечує більш високий вміст тирзепатиду у грамах на літр порції смоли, і зменшує кількість введень, необхідних для очищення неочищеного тирзепатиду в умовах, описаних у Прикладі 4. У цьому прикладі відкоригований вміст неочищеної сполуки Прикладу 4В у кількості 23,7 кг забезпечує одержання 25,4 кг сполуки Прикладу 4В (107 %) після RP1. Загальний об'єм розчину становить 2910 л при 8,72 г/л, і як тільки всі фракції пулу виявляються зібраними, суміш перемішують, відбирають проби, та зберігають до проведення очищення 2 (RP2) із застосуванням хроматографії з оберненою фазою. Очищення 2 (RP2) із застосуванням хроматографії з оберненою фазою: По суті той самий процес очищення, який описаний у Прикладі 4А, та із застосуванням методів, відомих фахівцю, застосовують для очищення 2 (RP2) із застосуванням хроматографії з оберненою фазою. У цьому прикладі 15,2 κг вміщеної сполуки Прикладу 4В з RP1 очищають до 13,8 кг сполуки Прикладу 4В з чистотою ~ 98 % після RP2. Загальний об'єм розчину становить 808 л при 17,0 г/л. Суміш зберігають до тангенціальної потокової фільтрації. Тангенціальна потокова фільтрація (TFF): Встановлюють мембрани TFF, і промивають їх водою. Амонійно-ацетатний буфер готують із використанням очищеної води з низьким граничним значенням вмісту ендотоксинів, оцтової кислоти та гідроксиду амонію. Потім завантажують ізопропанол для одержання буфера (5:95) 100 мМ NH4OAc, рН 8,0:IРА. Розчин 17 г/л RP2 сполуки Прикладу 4В концентрують шляхом TFF до ~125 г/л. Розчин RP2 рециркулюють, дозволяючи розчиннику проникати крізь мембрану, зберігаючи розчин пептиду на стороні утримування мембрани в розчині. Після концентрації буфер для діафільтрації подається в резервуар для утримування осаду на мембрані, у той час як розчинену речовину постійно збирають. Обмін буферу продовжують до досягнення бажаного складу розчинника та концентрації пептиду. Розчин випускають із системи, а одержаний поляризаційний шар змивають з мембрани, та об'єднують з пептидним концентратом. За допомогою TFF обробляють дві порції розчину RP2 (403,9 л при 17 г/л 9,87 κг АΡΙ). Осадження спільною подачею: Порції TFF поєднують (138,2 кг; 78,3 г/л) та за методом Карла Фішера визначають вміст вологи (8,9 %) для перевірки досягнення рівня <10 %. В окрему посудину поміщають МТВЕ (243 кг), і охолоджують до температури 0 °C. В посудин) для осадження додають IPА (48 кг), воду (6 кг) і МТВЕ (100 кг), і розчин охолоджують до температури 0 °C. Потоки з процесів TFF та МТВЕ подають у посудину для осадження зі швидкістю 1,6-1,8 кг/хв та 2,9-3,1 кг/хв, відповідно. Одержану суспензію витримують додатково протягом 0,7 год. при температурі 0 С, потім нагрівають до температури 15 С. Суспензію витримують при температурі 15 С протягом 1 год з подальшим додаванням МТВЕ (118 кг). Суспензію витримують при температурі 15 °С протягом 1 год, а потім охолоджують до температури 2,5 °C. Суспензію фільтрують охолодженою, і відфільтрований осад промивають МТВЕ (573 кг). Відфільтрований осад висушують до LOD<2 %. Зволоження: Матеріал прикладу 4В зволожують по суті так, як зазначено в Прикладі 4А, та із застосуванням методів, відомих фахівцю. Виділяють загалом 14,5 кг сполуки Прикладу 4В (послідовність SEQ ID NО: 1) із чистотою >97,7 % (за результатами ВЕРХ) та вмістом пептиду 88,4 %. Загальний вихід за загрузкою смоли Зібера становить 46 %. Приклад 5 Безперервний синтез Препарату 31 із застосуванням хімії конвергентного синтезу в потоці. Синтез Препарату 31 з пептидних фрагментів здійснюють із застосуванням в хімічному синтезі як періодичних методів, так і послідовного додавання фрагментів у трубчастий проточний реактор. Узагальнений підхід до синтезу включає сполучення двох фрагментів шляхом змішування двох розчинів разом зі сполучним агентові у трубчастому реакторі, за яким слідує додавання основи та додатковий час перебування у трубчастому реакторі для видалення Fmoc-захисної групи. Цим сполучені сполуки готуються до додавання наступного фрагмента. Надлишки реагентів, основи та розчинника видаляються між послідовними реакціями сполучення за допомогою нанофільтра з мембраною, розмір якої забезпечує утримання пептиду та проникнення домішок з нижчою молекулярною масою. Діафільтрацію застосовують для повного видалення домішок з нижчою молекулярною масою до наступних етапів сполучення. Опис та аналітичні результати прикладу цих перетворень наведені нижче. Високоефективну рідинну хроматографію застосовують для підтвердження синтезу Препарату 31 з Препарату 29 і Препарату 30. У згаданому методі дослідження застосовують колонку С4 зі стаціонарною фазою при температурі 65 °C (2,1 мм (внутрішній діаметр) × 150 мм × 1,7 мкм (розмір частинок)) з градієнтом В (0,1 % TFА у воді та ацетонітрилі) 60-98 % протягом 12 хв. Для цього матеріалу використовують УФ-детектування при 214 нм. У Таблиці А.5 наведені дані мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю, зібрані для продукту реакції сполучення у потоці на етапі 3 (Препарат 31). Точність маси підтверджує бажану сполуку. Таблиця А.5 Підтвердження визначеного Препарату 31 через точність маси, обчисленої за допомогою даних мас-спектрометрії з високою роздільною здатністю СполукаХімічна формулаТеоретична моноізотопна маса (нейтральна)Спостережуваний m/z іонівСтан зарядуОбчислена моноізотопна маса (нейтральна)Точність маси (млн-1)Препарат 31С334H512N48O746379,77771595,951246379,7756940,3 Нативне хімічне лігування являє собою процес, корисний для одержання пептидів повної довжини, що містять у послідовності цистеїн або аланін. У процесі застосовують хемоселективну реакцію двох незахищених пептидних сегментів, і одержують перехідний напівпродукт, зв'язаний зі складним тіоефіром. Зв'язаний зі складним тіоефіром напівпродукт перегруповують, і одержують продукт лігування повної довжини, що має нативний пептидний зв'язок на ділянці лігування. Фахівець візьме до уваги, що техніка нативного хімічного лігування може бути корисною при хімічному синтезі пептидів повної довжини, що містять цистеїн або аланін. Приклад 6 Процес нативного хімічного лігування Тирзепатид (послідовність SEQ ID NO: 1) Синтез на смолі Fmoc-Hydrazine-CTC (Препарат 32) Смола 2-СТС (10,7 г, 17,7 ммоль) набухає в 100 мл DCM протягом 20 хв при температурі 0 °C. 9-Флуоренілметилкарбазат (15,6 г. 61,4 ммоль. 3,5 екв) розчиняють у 210 мл DMF:DCM (2:1). До цього розчину 9-флуоренілметилкарбазату додають DIEA (31 мл, 178 ммоль, 10,1 екв). Потім цей розчин повільно додають до смоли при температурі 0 °C, перемішують при температурі 0 °C протягом години, і дозволяють нагрітися до кімнатної температури. Реакційну суміш перемішують протягом 16 год при кімнатній температурі. Потім додають метанол (10 мл) для гасіння залишку смоли 2-СТС, і перемішують протягом 15 хв. Смолу промивають спочатку 200 мл DMF, потім DMF (2×100 мл), водою (3×100 мл), DMF (3×100 мл), метанолом (3×100 мл) і, нарешті. DCM (3×100 мл). Смолу сушать у вакуумній печі при температурі 27 °C протягом 16 год. Навантаження смоли, визначене за результатами кількісного ЯМР, становить 0,74 ммоль/г. Синтез пептидного гідразиду (17-членного) (Препарат 33) Послідовність SEQ ID NO: 32 Смолу гідразин-СТС (1,01г, значення навантаження: 0,65 ммоль/г) поміщають в реакторну посудину об'ємом 40 мл; смола набухає у DCM (3×4 мл) (по 30 с кожного разу) з подальшим набуханням у DMF (2×10 мл) (по 20 хв кожного разу) у синтезаторі пептидів. Fmoc-lle-OH (0,919 г, 2,60 ммоль, 4 екв) та HBTU (0,99 г, 2,61 ммоль, 4 екв) розчиняють у 7 мл DMF. До розчину амінокислоти додають DIPEA (0,91 мл, 5,22 ммоль 8 екв), і об'єм доводять до 10 мл із застосуванням DMF. Активований розчин амінокислоти додають до смоли. Суміш змішують з азотом протягом 8 год. Через 8 год смолу промивають (5×10 мл) DMF, (5×10 мл) DCM, і сушать протягом 12 год. Навантаження смоли, що одержують, визначене за результатами кількісною ЯМР, становить 0,54 ммоль/г. 0,91 г цієї смоли використовують для синтезу Препарату 33 (послідовність SEQ ID NO: 32). Відщеплення захисної групи: 4×9 мл 20 % (у об'ємному відношенні) розчину піперидину в DMF, по 30 хв кожного разу. Сполучення: Для сполучення амінокислот використовують 3 екв амінокислоти, 3 екв ΟΧΥΜА і 3,3 екв DIC. Смолу промивають (5×9 мл) DMF з перемішуванням Ν2 протягом 1 хв після кожного сполучення та кінцевого повторення операції відщеплення захисної групи. Після закінчення синтезу пептидного гідразиду смолу промивають DCM з перемішуванням N2. Смолу сушать на синтезаторі. Відщеплення захисної групи та розщеплення: До висушеної смоли (2,37 г) додають 25 мл коктейлю для розщеплення (5 % (у відношенні маси до об'єму) дитіотреїтолу (DTT), 2,5 % (у об'ємному відношенні) води, 2,5 % (у об'ємному відношенні) триізопропілсилану (TIPS) та 90 % трифтороцтової кислоти (ТFА)), і перемішують протягом 3 год на роторному змішувачі. Смолу фільтрують, і промивають (2×2,5 мл) TFA. Фільтрат виливають у 175 мл холодного МТВЕ, і пептид негайно випадає в осад. Фільтраційну колбу промивають (2×2,0 мл) TFA, і змиви виливають у холодний МТВЕ. Суміш охолоджують до температури -20 °C протягом півгодини, а потім центрифугують. Після цього осад пептиду двічі промивають 150 мл МТВЕ, і центрифугують. Осад пептиду сушать у вакуумній печі при температурі 27 °C протягом 16 год. Після висихання одержують 1,25 г зразок неочищеного Препарату 33 [Очікувана (маса+2Н+)/2=968,4883, спостережувана (маса+2Н+)/2=968,4879]. Приблизно 0,62 ммоль Препарату 34 синтезують на амідній смолі Зібера за стандартними протоколами SPPS. Fmoс-Lys (ivDde)-OH використовують для ортогонального відщеплення захисної групи та ацилювання лізину. Відщеплення захисної групи ivDde: Гідразину моногідрат (64 % (у масовому відношенні) (1,98 г, 25,3 ммоль) розбавляють до 24,4 г DMF і 20 г додають до смоли. Суспензію перемішують потоком азоту. Приблизно через дві години промивають (5×9 мл) DMF. Промивання повторюють ще один раз. 2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-5-трет-бутокси-4-[(20-трет-бутокси-20-оксо-ікозаноїл)аміно]-5-оксо-пентаноїл]аміно]етокси]ацетил]аміно]етокси)етокси]оцтову кислоту (1094,4 мг, 1,252 ммоль, 2 екв) розчиняють у 10 мл безводного DMF. До цієї суміші додають TNTU (506,9 мг, 1,360 ммоль, 2,2 екв) та DIEA (0,24 мл, 1,4 ммоль, 2,2 екв). Об'єм доводять до 15 мл за допомогою безводного DMF. Цю суміш перемішують протягом 30 хв на роторному змішувачі. Потім активований складний ефір Препарату 6 додають до смоли, і протягом 12 год перемішують потоком азоту. Через 12 год розчин зливають, і смолу промивають (5×10 мл) DMF і (7×10 мл) DCΜ із перемішуванням Ν2 протягом 1 хв. Смолу сушать протягом 8 год на синтезаторі. Відщеплення захисної групи та розщеплення: До висушеної смоли (2,42 г) додають 20 мл коктейлю для розщеплення (5 % (у відношенні маси до об'єму) дитіотреїтолу (DTT), 2,5 % (у об'ємному відношенні) води, 2,5 % (у об'ємному відношенні) триізопропілсилану (TIPS) та 90 % трифтороцтової кислоти (TFA), і перемішують протягом 3 год на роторному змішувачі. Смолу фільтрують, і промивають (2×2,0 мл) TFA. Фільтрат виливають у 200 мл холодного МTBE, і пептид негайно випадає в осад. Фільтраційну колбу промивають (2×2 мл) TFA, і змиви виливають у холодний МTBE. Суміш охолоджують до температури -20 °С протягом 30 хв, і потім центрифугують. Осад пептиду сушать у вакуумній печі при температурі 27 °C протягом 14 год. Після висихання одержують 1,853 г неочищеного Препарату 34. Його очищають із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою на 10 мкм колонці Kromasil 100-10-С8 (30 мм × 250 мм) при температурі навколишнього середовища з лінійним градієнтом 30-55 % ацетонітрилу у воді протягом 25 хв після 15 % ацетонітрилу у воді перші 5 хв і TFA постійної концентрації, яка становить 0,1 %, протягом 30 хв. Одержують 1,28 г очищеного препарату 34 (послідовність SEQ ID NO: 33) [Очікувана (Maca+2H+)/2=1470,7929, спостережувана (маса+2Н+)/2=1470,7885]. Синтез складного тіоефіру (перетворення Препарату 33 на Препарат 35). Неочищений пептидний гідразид (Препарат 33, 2,422 г, 1,251 ммоль) розчиняють у 50 мл буфера для лігування (6 Μ гуанідин) гідрохдориду та 0,2 Μ одноосновного гідрофосфату натрію, рН 3,35), і охолоджують до температури -15 °C на ацетоно-льодяній бані. До розчину пептидного гідразиду додають 9,4 мл 1 Μ розчину нітриту натрію (9,4 ммоль, 7,5 екв), і дозволяють перемішуватися протягом 20 хв при температурі -15 °C. Тим часом 1 мл 2,2,2-трифторетантіоду (TFET) доводять до 10 мл буфером для лігування (6 Μ гуанідину гідрохдориду та 0,2 Μ дигідрофосфату натрію, рН 7,0). Через 20 хв 10 мл суміші ТFЕТ додають до розчину пептидного гідразиду зі спричиненням in-situ тіолізу пептидил азиду, одержаного з Препарату 33. рН реакційної суміші доводять приблизно до 6,95 5н розчином гідроксиду натрію. Тіоліз пептидил азиду здійснюють протягом 45 хв, і об'єм доводять до 100 мл буфером для лігування (рН 7,0). Неочищену суміш складних тіоефірів очищають із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою на 10 мкм колонці Waters X-Bridge C18 (10 мм × 250 мм) при температурі навколишнього середовища з лінійним градієнтом 25-42 % ацетонітрилу у воді протягом 25 хв після 10 % ацетонітрилу у воді протягом перших 2,8 хв і TFА постійної концентрацій яка становить 0,1 %, протягом 28 хв очищення. Одержують 1,03 г тіоефіру TFET (Препарат 35 (послідовність SEQ ID NO: 34)) [очікувана (маса+2H+)/2=1010,4650, спостережувана (маса+2Н+)/2=1010,4620]. Нативне хімічне лігування: Водний 6 Μ розчин гуанідину гідрохлориду та 0,3 Μ розчин дигідрофосфату натрію (рH 7,0) є буфером для лігування, що застосовують в нативному хімічному лігуванні. Всі розчини виготовляють в цьому буфері для лігування, 350,4 мг (0,174 ммоль) складного тіоефіру пептиду, Препарату 35 (послідовність SEQ ID NO: 34), розчиняють у 50 мл буферу для лігування. До розчину складного тіоефіру пептиду додають 8,0 мл порцію 0,5 Μ розчину 4-меркаптофенілоцтової кислоти (ΜΡΑА). N-кінцевий цистеїнвмісний пептид (Препарат 34 (послідовність SEQ ID NO: 33), 524,6 мг. 0,178 ммоль. 1,03 екв) розчиняють у 48 мл буфера для лігування в 50 мл центрифужній пробірці. Розчин Препарату 34 додають до розчину складного тіоефіру. Пробірку промивають 2×8 мл буфера для лігування (рН приблизно 7,0), і змиви додають до реакційної суміші. рН реакційної суміші доводять до приблизно 7 5н розчином NaOH. До реакційної суміші додають 8,0 мл порцію трис(2-карбоксіетил)фосфіну (ТСЕР, 0,5 Μ, рН 7,0), і рН знову доводять до 7,0 із застосуванням 0,2 мл 5н розчину гідроксиду натрію. Реакційній суміші дозволяють перемішуватися при кімнатній температурі протягом 24 год, а потім зберігають у морозильній камері. Перед очищенням додатково додають 3 мл 0,5 Μ розчину ТСЕР. Препарат 36 (послідовність SEQ ID NO: 35) очищають із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою на 10 мкм колонці Kromasil С18 (10 мм × 250 мм) при температурі навколишнього середовища з лінійним градієнтом 20-50 % ацетонітрилу у воді (0,1 % оцтової кислоти та відтитрована до рH 9,0) протягом 23 хв після 10 % ацетонітрилу у воді протягом перших 4 хв протягом 28 хв очищення. Після очищення одержують приблизно 372 мг (44,3 %) аналогічного цистеїну тирзепатиду Препарату 36 [Очікувана (маcа+3Н+)/3=1615,17263, спостережувана (маса+3H+)/3=1615,1686]. Десульфуризація: Водний розчин 6-гуанідину гідрохлориду та 0,3 Μ розчин дигідрофосфату натрію (рH 7,0) є буфером, що застосовують при десульфуризації. Всі розчини були зроблені в цьому буфері. 2,2'-азобіс[2-(2-імідазолін-2-іл)пропан]дигідрохлорид (Препарат 37, 808,2 мг, 23 ммоль) розчиняють у 10 мл буфера, і рН доводять приблизно до 7,0 за допомогою 5н NaOH. Об'єм буфером доводять до 15 мл. Аналогічний цистеїну тирзепатиду Препарат 36 (105,2 мг, 0,022 ммоль) розчиняють у 30 мл буфера, і до нього додають 6 мл розчину Препарату 37. До цього розчину додають 5 мл 0,3 Μ розчину відновленого L-глутатіону (L-GSH. pH 7,0) та 7,5 мл 0,5 Μ розчину ТСЕР (рH 7,0)). Розчин нагрівають при температурі 44 °C протягом 4,5 год, при чому, за результатами дослідження, яке виконують із застосуванням ультра високоефективної рідинної хроматографії, виявляється, то реакція завершена [Очікувана (маса+3Р+)/3=1604,5153. спостережувана (маса-3H+)/3=1604,5 122]. Вихід реакції десульфуризації обчислюють із застосуванням ультра високоефективної рідинної хроматографії, застосовуючи еталонний стандарт тирзепатиду (послідовність SEQ ID NO: 1). Вихід, за оцінкою, становить 47 %. Haтивне хімічне лігування (метод 2): Синтез пептидного гідразиду, Препарат 39 (Послідовність SEQ ID NO: 36) Смолу гідразин-СТС (2,03 г, 1,32 ммоль, значення навантаження: 0,65 ммоль/г) вносять у 40 мл реакторну посудину. Смола набухає спочатку (3×10 мл) у DCM (по 30 с кожного разу), потім (2×10 мл) у DMF (20 хв кожного разу) у синтезаторі Symphony. HBTU (1,48 г, 3,90 ммоль, 3,0 екв) розчиняють у 13,1 мл розчину (25S, 52S)-52-((((9H-флуорен-9-іл)метокси)карбоніл)аміно)-25-(трет-бутоксикарбоніл)-2,2-диметил-4,23,28,37,46-пентаоксо-3,32,35,41,44-пентаокса-24,29,38,47-тетраазатрипентаконтан-53-ової кислоти (Препарат 17, 365 мг/мл у DMF) (3,91 ммоль. 3,0 екв). До вищевказаного розчину додають DIPEA (1,4мл, 8,04 ммоль, 6,1 екв), і об'єм доводять до 19 мл за допомогою DMF. Розчину дозволяли перемішуватися на роторному змішувачі при кімнатній температурі протягом 30 хв. До смоли додають розчин активованого складного ефіру Препарату 17. Суспензію перемішують азотом протягом 8 год. Через 8 год. смолу промивають (5×10 мл) DMF, (5×10 мл) DCM, і сушать протягом 12 год. Навантаження одержаної смоли, визначене за даними кількісного ЯМР. становить 0,26 ммоль/г. 1,82 г цієї смоли використовують для синтезу Препарату 39 (послідовність SEQ ID NО: 36), пептидного гідразиду. Відщеплення захисної групи: 4×9 мл 20 % (у об'ємному відношенні) розчину піперидину в DMF, по 30 хв кожного разу. Сполучення: Для сполучення амінокислот використовують 3 екв амінокислоти. 3 екв ΟΧΥΜА та 3,3 екв DIC. Смолу промивають (5×9 мл) DMF з перемішуванням N2 протягом 1 хв після кожного сполучення та кінцевого повторення відщеплення захисної групи. По закінченні синтезу пептидного гідразиду смолу промивають (7×10 мл) DCM з перемішуванням N2 протягом 1 хв. Потім смолу висушують протягом 12 год. на синтезаторі. Відщеплення захисної групи та розщеплення: До висушеної смоли додають 25 мл коктейлю для розщеплення (5 % (у відношенні маси до об'єму) дитіотреїтолу (DТТ). 2,5 % (у об'ємному відношенні) води, 2.5 % (у об'ємному відношенні) триізопропілсилану (TIPS) та 90 % трифтороцтової кислоти (TFА)), і перемішують на роторному змішувачі. Смолу фільтрують, промивають (2×2,5 мл) TFA, і фільтрат виливають у 175 мл холодного ΜTBE. Фільтраційну колбу промивають (2×2,5 мл) TFA, і змиви виливають у холодний МТВE. Суміш охолоджують до температури -20 °C протягом 30 хв. а потім центрифугують. Після цього осад пептиду двічі промивають 150 мл МТВЕ, і центрифугують. Осад пептиду сушать у вакуумній печі при температурі 27 °C протягом 16 год. Після висихання одержують 1,70 г неочищеного Препарату 39 (послідовність SEQ ID NO: 36) (гідразид пептиду). Неочищений Препарат 39 (гідразид пептиду) очищають із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою на 10 мкм колонці Waters XSeleetCSH С18 (10 мм × 250 мм) при температурі навколишнього середовища з лінійним градієнтом 20-55 % ацетонутрилу у воді протягом 23 хв після 10 % ацетонітрилу у воді перші 5 хв, і TFA постійної концентрації яка становить 0,1 %, протягом 28 хв очищення. Одержують приблизно 110 мг частково очищеного Препарату 39 (гідразид). Відщеплення захисної групи та розщеплення: До висушеної смоли (2,92 г) додають 25 мл коктейлю для розщеплення (5 % (у відношенні маси до об’єму) дитіотреїтолу (DTT). 2,5 % (у об'ємному відношенні) води. 2,5 % (у об'ємному відношенні) триізопропілсилану (TIPS) та 90 % трифтороцтової кислоти (TFA)), і перемішують на роторному змішувачі. Смолу фільтрують, і промивають (2×2,5 мл) TFA. Фільтрат виливають у 200 мл холодного MTBE, і пептид негайно випадає в осад. Після цього фільтраційну колбу промивають (2×2 мл) TFA, і змиви виливають у холодний МТВЕ. Суміш охолоджують до температури -20 °C протягом 30 хв. а потім центрифугують. Після цього осад пептиду двічі промивають 240 мл ΜТВЕ і центрифугують. Потім осад пептиду сушать у вакуумній печі при температурі 27 °C протягом 16 год. Одержують приблизно 1,7 г неочищеного 19-членного Препарату 40 (послідовність SEQ ID NО: 37). Нативне хімічне лігування: Водний 6 Μ розчин гуанідину гідрохлориду та 0,3 Μ розчин дигідрофосфату натрію (рН 7,0) с буфером для лігування, що застосовують в нативному хімічному літуванні. Всі розчини виготовляють в цьому буфері для лігування. Частково очищений пептидний гідразид (Препарат 39, 56 мг, 0,019 ммоль) розчиняють у 5 мл буфера для лігування (6 Μ гуанідину гідрохлорид та 0,3 Μ дигідрофосфат натрію, рН 3,35), і охолоджують до температури -15 °C в ацетоново-льодяній бані. До розчину пептидного гідразиду додають 0,25 мл 1 Μ розчину нітриту натрію (0,25 ммоль 13,2 екв), і дозволяють перемішуватися протягом 10 хв при температурі -15 °C. Через 10 хв до розчину пептидного гідразиду додають 0,8 мл 0,5 Μ розчину 4-меркаптофенілоцтової кислоти (МРАА) для спричинення in-situ тіоліза пептидил азиду, одержаного з Препарату 39. рН реакційної суміші доводять приблизно до 7,0 5н розчином гідроксиду натрію. Тіоліз пептидил азиду триває протягом 30 хв. Приблизно 0,62 ммоль Препарату 40 (послідовність SEQ ID NО: 37) синтезують на амідній смолі Зібера із застосуванням стандартних протоколів SPPS. N-кінцевий цистеїнвмісний Препарат 40 (26,1 мг, 0,014 ммоль, 0,74 екв) розчиняють у 1 мл буфера для лігування. Розчин Препарату 40 додають до розчину складного тіоефіру. Пробірку, що містить Препарат 40, промивають 1 мл буфера для лігування (рH 7,0), і змив додають до реакційної суміші. Через 15 хв до реакційної суміші додають 1,0 мл трис(2-карбоксіетил)фосфіну (ТСЕР, 0,5 М, рН 7,0), і рН доводять до 7,0 5н розчином гідроксиду натрію. Реакційній суміші дозволяють перемішуватися при кімнатній температурі протягом однієї години. В реакційній суміші виявляють аналог цистеїну тирзепатиду (Препарат 42). Послідовності SEQ ID NO: 1 Тирзепатид YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLІAGGPSSGAPPPS де Χ1 являє собою Aib; X2 являє собою Aib; Κ у положенні 20 є хімічно модифікованим шляхом кон’югації з епсилон-аміногрупою бічного ланцюгу К (2-[2-(2-аміноетокси)етокси]ацетил)2-(-Glu)1-СО-(СН2)18-СO2Н; і C-кінцева амінокислота є амідованою як С-кінцевий основний амід SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEG ID NO:22 SEG ID NO:23 SEG ID NO:24 SEG ID NO:25 SEG ID NO:26 SEG ID NO:27 SEG ID NO:28 SEG ID NO:29 SEG ID NO:30 SEG ID NO:31 SEG ID NO:32 SEG ID NO:33 SEG ID NO:34 SEG ID NO:35 SEG ID NO:36 SEG ID NO:37 SEG ID NO:38 SEG ID NO:39 SEG ID NO:40