СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ЗАСОБУ З АНТИОКСИДАНТНОЮ І ПРОТИЗАПАЛЬНОЮ АКТИВНІСТЮ З ПАГОНІВ МАЛИНИ ЗВИЧАЙНОЇ

Спосіб одержання засобу з антиоксидантною і протизапальною активністю з рослинної сировини, що включає двократну екстракцію рослинної сировини екстрагентом у співвідношенні 1:20, об'єднання одержаних витяжок, відстоювання протягом доби, фільтрацію та упарювання фільтрату до маси наважки рослинної сировини 1:2, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують пагони малини звичайної, та проводять двократну екстракцію 60 % етанолом.

Винахід належить до фармації і медицини, а саме стосується засобів, що містять біологічні активні речовини рослинного походження, зокрема - способу одержання лікарського засобу з антиоксидантною і протизапальною активністю з пагонів малини звичайної. Відомий спосіб отримання поліфенольного комплексу "Флавітин" з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною активністю з листя винограду сорту Дабуш [1], що включає екстракцію сировини 50 % спиртом етиловим, при співвідношенні сировина екстрагент 1:10 з подальшим упарюванням, фільтрацією, ресорбцією фенольних сполук з осаду водою, упарюванням і сушінням. До недоліків відомого способу можна віднести однократну екстракцію, яка не дозволяє досягнути максимального витягання із сировини поліфенольних сполук. Існує спосіб отримання комплексу біологічно активних речовин у формі сухого екстракту з противиразковою, протизапальною та мембраностабілізуючою дією з листя ліщини звичайної або грабу звичайного [2] шляхом триразовою екстракцією водою за температури 50-60 ºС при співвідношенні сировини і екстрагенту (1:10)-(1:15) протягом 4-5 годин. До недоліків відомого способу можна віднести тривалість процесу та недостатню антиоксидантну дію засобу. Відомий спосіб отримання засобу [3], що має антиоксидантну дію, в якому подрібнене листя зеленого чаю, екстрагують двократно хлороформом, потім 60 % спиртом етиловим у співвідношенні сировина екстрагент 1:10-1:20, очищають і упарюють до співвідношення кількості екстракту і сировини 1:2. Недоліком даного способу за прототипом можна вважити використання хлороформу, що ускладнює, здорожує процес отримання екстракту та використання рослинної сировини, яка не культивується в Україні. Завданням винаходу є розробка способу одержання засобу з антиоксидантною і протизапальною активністю з пагонів малини звичайної. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання засобу з антиоксидантною і протизапальною активністю з пагонів малини звичайної, що включає двократну екстракцію рослинної сировини 60 % етанолом, у співвідношенні 1:20 протягом доби, очищення проводять відстоюванням та відокремленням надосадової рідини, яку піддають концентруванню у вакуум-випарному апараті за температури 50-60 °C до співвідношення кількості фільтрату і маси наважки рослинної сировини 1:2. В одержаному екстракті з пагонів малини звичайної містяться фенольні сполуки: катехіни, флавоноїди, гідроксикоричні кислоти; органічні кислоти, в тому числі амінокислоти; макро- та мікроелементи. Отриманий екстракт може бути використаний для отримання дієтичних добавок, лікарських препаратів з антиоксидантною і протизапальної активністю. Експериментальним шляхом встановлено, що ефективним при проведенні екстракції заявленим способом є використання співвідношення сировини і екстрагенту як 1:20. При цьому, якщо співвідношення менше 1:20, не забезпечується достатня екстракція біологічно активних речовин (БАР), що призводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Навпаки, якщо співвідношення більше 1:20, це веде до ускладнення та подовження технологічного процесу та підвищення енерговитрат. Встановлене оптимальне співвідношення сировина:екстрагент як 1:20, при якому забезпечується максимальна екстракція БАР, час упарювання мінімальний та дозволяє отримувати екстракт на стандартному обладнанні без додаткового перезавантаження первинної сировини. Винахід ілюструється прикладами Приклад 1 100 г пагонів малини звичайної, подрібненого до розміру часток 2-3 мм, поміщали в колби, заливали 2 літрам 60 % спиртом етиловим і екстрагували протягом доби за кімнатної температури. Екстракцію повторювали двічі з новими порціями екстрагенту (2 л). Одержані витяжки об'єднували, відстоювали протягом доби, відфільтровували. Фільтрат упарювали за допомогою ротаційного вакуум-випарного апарата до співвідношення фільтрату і маси наважки рослинної сировини 1:2, тобто до об’єму 200 мл. Приклад 2 Антиоксидантну активність екстракту з пагонів малини звичайної визначали з використанням потенціометричної методики, яка базується на різкій зміні потенціала платинового електрода, поміщеного в буферний розчин, що містить медіаторну систему K4[Fe(CN)6] і K3[Fe(CN)6] після додавання досліджуваного зразка у вимірювальну електрохімічну комірку і є результатом зміни співвідношення окисленої і відновленої форми компонентів медіаторної системи. Для порівняння результатів досліджували антиоксиданту активність "Аскорутин". Антиоксидантну активність визначали наступним чином: В електрохімічну комірку вносили 50,0 мл медіаторної системи, яка складалася з K4[Fe(CN)6] і K3[Fe(CN)6] з концентрацією 0,002/0,00002 М, відповідно; 1,0 мл досліджуваного лікарського засобу з пагонів малини звичайної додавали до електрохімічний комірки. Антиоксиданту активність розраховували на підставі отриманої різниці потенціалів по формулам (1-2) і виражали в молях еквівалентів антиоксидантів на масу сухого залишку екстракту (ммоль-екв./mсух. зал.). Отримані дані при n=3 в кожному досліді обробляли статистично. , (1) , (2) де: Сox - концентрація K3[Fe(CN)6] в електрохімічній комірці, моль/л; Сred - концентрація K4[Fe(CN)6] в електрохімічній комірці, моль/л; Kdil - коефіцієнт розведення; Еethanol - 0,0546·С% - 0,0091; С% - концентрація етанолу; m1 - маса сухого залишку екстракту; m2 - маса сухого залишку в 1 мл екстракту; n - кількість електронів в електродній реакції (n=1); F - постійна Фарадея (F=96485,333 Кл/моль); R - універсальна газова стала (R=8,314 Дж/моль × K); T - температура розчину,° K. Результати вивчення антиоксидантної активності засобу, одержаного за заявленим способом, наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Дослідження антиоксидантної активності засобу, одержаного за заявленим способом ПрепаратАнтиоксидантна активність при n=3, ммоль-екв./mсух. ост.60 % спиртовий екстракт пагонів малини звичайної119,13±2,38Аскорутин51,10±1,02 Приклад 3 Протизапальна активність 60 % спиртового екстракту пагонів малини звичайної була вивчена на 32 білих безпородних щурів-самців масою 180-220 г, на яких була створена модель гострого запалення, індукованого субплантарною ін'єкцією 0,1 мл 1 % карагінану (Fluka, Швейцарія) у праву задню лапу щурів. Вимірювання набряку лапи у щурів проводили через 1, 2, 3, 8, 24 години з урахуванням того, що після введення максимальний набряк карагінану спостерігається до третій годині, потім набряк поступово зменшується протягом дня [4]. Для цього обсяг лап см3 вимірювали за допомогою цифрового плетизмометра Panlab (Іспанія) моделі LE 7500 версії V29/10/2014. Величина набряку в кожному у випадку визначалася різницею в обсязі між набряклими та здоровими лапами і виражалася %, показуючи, наскільки досліджуваний препарат пригнічує розвиток набряку порівняно з контролем, де величина набряку приймалася як 100 %. Антиексудативна активність 60 % спиртового екстракту пагонів малини звичайної та препарату порівняння розраховували за формулою: , (3) де, А - антиексудантна активність, %; Ms - об'єм набряклої лапи в досліді; Mh - об'єм здорової лапи в досліді; Msh - об'єм набряклої лапи в контролі; Mhc - об'єм здорової лапи в контролі. Усіх тварин розділили на 4 груп. Перша група - контрольна патологія (тваринам, яким субплантарно вводили розчин карагінану та внутрішньошлунково 0,5 мл/кг дистильованої води). Друга група - тварини, яким субплантарно вводили розчин карагінану, а досліджуваний екстракт - внутрішньошлунково у 1 мл/кг. Тваринам 3 груп внутрішньошлунково вводили препарати порівняння на тлі введення карагінану: диклофенак натрію в дозі 8 мг/кг; 4 групу становили інтактні тварини, яким вводили 0,1 мл фізіологічного розчину субплантарно. Результати вивчення протизапальної активності засобу, одержаного за заявленим способом, наведені у таблиці 2. Таблиця 2Вплив досліджуваного екстракту на процес ексудації при запаленні карагінану у щурів (M±m, n=8, р<0,05)ДосліджуванийзразокДоза% пригнічення набряку порівнянно з контролем продовж часу1 година2 година3 година8 година24 година60 % спиртовий екстракт пагонів малини звичайної25 мг/кг43,1±2,646,4±7,224,2±3,819,6±7,2Диклофенак натрію8 мг/кг32,4±3,740,5±5,154,6±4,836,7±5,924,7±3,3 Результати досліджень у таблиці 1 свідчать про наявність антиоксидантної дії 60 % спиртового екстракту пагонів малини звичайної, що перевищує рівень дію препарату порівняння "Аскорутин" на 57 %. Аналіз даних таблиці 2 показав, що 60 % спиртовий екстракт пагонів малини звичайної в дозі 1,0 мл/кг має протинабрякова дію протягом всього періоду експерименту. Особливо виражений антиексудативний ефект 60 % спиртового екстракту пагонів малини звичайної в дозі 1,0 мл/кг виявлявся протягом перших три години після введення карагінану. Так, при дозі 1,0 мл/кг - 49,8 %. Через 8 годин після введення карагінану 60 % спиртовий екстракт пагонів малини звичайної трохи слабше пригнічував розвиток набряку, ніж диклофенак натрію 36,7 %. Через 24 години антиексудативна активність 60 % спиртового екстракту пагонів малини звичайної склала 19,6 % (для дози 1,0 мл/кг) і 24,7 % для диклофенаку натрію. Згідно наведених результатів, 60 % спиртовий екстракт пагонів малини звичайної має характерну протизапальну активність. Таким чином, заявлений спосіб одержання засобу з антиоксидантною і протизапальною активністю з пагонів малини звичайної, який відзначається рядом переваг: 1) простота та можливість проведення на стандартному обладнанні у промислових умовах України; 2) використання як екстрагенту розчину 60 % етилового спирту, що робить спосіб доступним, екологічно безпечним, дешевим, таким що не вимагає роботи з отруйними та шкідливими для здоров'я людини реактивами; 3) наявність вираженої антиоксидантної активності екстракту з пагонів малини звичайної, одержаного за заявленим способом; 4) перспективність використання одержаного екстракту як лікарської субстанції для одержання різних лікарських форм. Джерела інформації: 1. Спосіб одержання поліфенольного комплексу "Флавітин" з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною активністю: пат. 59681 A Україна: A61K 36/87, A61K 127/00, C11B 1/10, A61P 29/00, A61P 39/06. № 2002119121; заявл. 15.11.2002; опубл. 15.09.2003, Бюл. № 9. 8 с. 2. Спосіб одержання комплексу біологічно активних речовин з антиоксидантною та протизапальною дією: пат. 86502 Україна: A61K 36/899, A61K 127/00, A61P 7/10, A61P 11/02, A61P 17/08, A61P 39/06. № a200708446; заявл. 23.07.2007; опубл. 27.04.2009, Бюл. № 8. 8 с. 3. Спосіб одержання засобу з антиоксидантною дією з листя зеленого чаю: пат. 150496 Україна: A61K 127/00, A61P 39/06, A61K 36/82. № u202105657; заявл. 07.10.2021; опубл. 24.02.2022, Бюл. № 8. 3 с. 4. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. руководство: навч. посіб. / ред. О. В. Стефанов. Киев: Вид. дом "Авиц", 2001. 528 с.