АГОНІСТИ РЕЦЕПТОРІВ ГЛЮКАГОНОПОДІБНОГО ПЕПТИДУ-1

1. Сполука, вибрана з: , , та , або її фармацевтично прийнятна сіль. 2. Сполука за п. 1, вибрана з: , , та , або її фармацевтично прийнятна сіль. 3. Сполука за п. 2, де згадана сполука являє собою: , або її фармацевтично прийнятна сіль. 4. Сполука за п. 3, яка являє собою трет-бутиламінову сіль: . 5. Фармацевтична композиція, що містить сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль за будь-яким із пп. 1-4 і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. 6. Спосіб лікування цукрового діабету 2 типу у ссавця, який включає введення ссавцю ефективної кількості сполуки за будь-яким із пп. 1-4 або її фармацевтично прийнятної солі. 7. Спосіб зниження рівня глюкози в крові у ссавців, який включає введення ефективної кількості сполуки за будь-яким із пп. 1-4 або її фармацевтично прийнятної солі. 8. Спосіб лікування гіперглікемії у ссавця, який включає введення ссавцю ефективної кількості сполуки за будь-яким з пп. 1-4 або її фармацевтично прийнятної солі. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 6-8, який відрізняється тим, що згадану сполуку вводять пероральним шляхом. 10. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за будь-яким із пп. 1-4 для застосування в терапії. 11. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за будь-яким із пп. 1-4 для застосування в лікуванні цукрового діабету 2 типу. 12. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за будь-яким із пп. 1-4 для застосування в зниженні рівня глюкози в крові. 13. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль за будь-яким iз пп. 1-4 для застосування в лікуванні гіперглікемії. 14. Сполука або її фармацевтично прийнятна сіль для застосування за будь-яким з пп. 10-13, при цьому сполуку мають вводити пероральним шляхом. 15. Застосування сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за будь-яким із пп. 1-4 у виробництві лікарського засобу для лікування цукрового діабету 2 типу. 16. Застосування сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за будь-яким із пп. 1-4 у виробництві лікарського засобу для зниження рівня глюкози в крові. 17. Застосування сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за будь-яким із пп. 1-4 у виробництві лікарського засобу для лікування гіперглікемії.

Цей винахiд стосується агонiстiв рецепторiв глюкагоноподiбного пептиду-1 i терапевтичних застосувань згаданих сполук для лiкування цукрового дiабету 2 типу. Глюкагоноподiбний пептид-1 (GLP-1) є членом пептидних гормонiв з родини інкретину, якi видiляються ентероендокринними L-клiтинами кишечнику. GLP-1 спричинює вивiльнення iнсулiну з бета-клiтин глюкозозалежним чином. Однак GLP-1 швидко метаболiзується, тому лише невеликий вiдсоток GLP-1 може бути використаний для спричинення секрецiї iнсулiну. Для компенсування цього, з метою посилення секрецiї iнсулiну, були розробленi агонiсти рецепторiв GLP-1 (GLP-1R) як лiкарський засiб для цукрового дiабету 2 типу. Бiльшiсть агонiстiв GLP-1R, якi були схваленi для лiкування цукрового дiабету 2 типу, є iн'єкцiйними препаратами. Пацiєнти часто вiддають перевагу лiкарським засобам, що вводяться пероральним шляхом, через недолiки, пов'язанi з iн'єкцiєю, такi як незручнiсть, бiль i можливiсть подразнення в мiсцi iн'єкцiї. WO2018/109607 розкриває певнi похiднi бензимiдазолу, якi описано як агонiсти GLP-1R. Однак iснує потреба в альтернативних агонiстах GLP-1R. Зокрема, iснує потреба в агонiстах GLP-1R, якi можуть бути введенi пероральним шляхом. Iснує особлива потреба в агонiстах GLP-1R, якi мають покращену дiю, сприятливий токсикологiчний профiль та/або фармакокiнетичний профiль, який пiдтримує введення доз один раз на добу. Вiдповiдно, цим винаходом надана сполука Формули: Формула I, де R1 являє собою Н або F; R2 являє собою Н або F; i R3 являє собою Н або СН3; або її фармацевтично прийнятна сiль. Формула I охоплює всi окремi енантiомери, їх сумiшi, так само як i рацемати, i їх фармакологiчно прийнятнi солi. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули: Формула Ia, або її фармацевтично прийнятна сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули: Формула II, де R1 являє собою Н або F, або її фармацевтично прийнятна сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули: Формула ІІа, де R1 являє собою Н або F, або її фармацевтично прийнятна сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. У варіанті здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. У варіанті здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. У варіанті здiйснення цього винаходу, якому вiддають особливу перевагу, надана трет-бутиламiнова сiль (також вiдома як ербумiнова сiль): . В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули: Формула III, де R2 являє собою Н або F, або її фармацевтично прийнятна сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули: Формула IІІa, де R2 являє собою Н або F, або її фармацевтично прийнятна сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згадана сполука являє собою сполуку Формули: або її фармацевтично прийнятну сiль. Формула I охоплює Формулу Ia, Формулу ІІb, Формулу III, Формулу IIIa, Формулу IIIb, Формулу IIII, Формулу IIIIа i Формулу IIIIb, i посилання на наведену нижче Формулу I, наприклад, у способах лiкування та терапевтичних застосуваннях, також слiд читати як посилання на кожну i yci з цих пiдформул. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу надана фармацевтично прийнятна композицiя, що мiстить сполуку Формули I або її фармацевтично прийнятну сiль, i щонайменше один фармацевтично прийнятний носiй, розрiджувач або наповнювач. У варiантi здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, фармацевтично прийнятнiй комПозиції надана форма для перорального введення. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу наданий спосiб лiкування ссавця вiд цукрового дiабету 2 типу, при цьому згаданий спосiб включає введення ссавцю, що потребує лiкування, фармацевтично прийнятної комПозиції, яка мiстить ефективну кiлькiсть сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi i щонайменше один фармацевтично прийнятний носiй, розрiджувач або наповнювач. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу фармацевтично прийнятнiй комПозиції надається форма для перорального введення. Переважно згаданим ссавцем є людина. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу наданий спосiб лiкування ссавця вiд цукрового дiабету 2 типу, при цьому згаданий спосiб включає введення ссавцю, що потребує лiкування, ефективної кiлькостi сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi. У варіанті здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згаданим ссавцем є людина. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу наданий спосiб зниження рівня глюкози в кровi ссавця, при цьому згаданий спосiб включає введення ссавцю, що потребує лiкування, ефективної кiлькостi сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi. У варiантi здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згаданим ссавцем є людина. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу наданий спосiб зниження гiперглiкемїї у ссавця, при цьому згаданий спосiб включає введення ссавцю, що потребує лiкування, ефективної кiлькостi сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi. У варiантi здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, згаданим ссавцем є людина. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надана сполука Формули I або її фармацевтично прийнятна сiль для застосування в терапiї. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу надана сполука Формули I або її фармацевтично прийнятна сiль для застосування в лiкуваннi цукрового дiабету 2 типу. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу надана сполука Формули I або її фармацевтично прийнятна сiль для застосування в зниженнi рiвня глюкози в кровi. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу надана сполука Формули I або її фармацевтично прийнятна сiль для застосування в лiкуваннi гiперглiкемii В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надане застосування сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi для виготовлення лiкарського засобу для лiкування цукрового дiабету 2 типу. В одному з варіантів здiйснення цього винаходу пропонується застосування сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi для виготовлення лiкарського засобу для зниження рiвня глюкози в кровi. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу надане застосування сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi для виготовлення лiкарського засобу для лiкування гiперглiкемiї. У варiантi здiйснення цього винаходу, якому віддають перевагу, сполуку Формули I вводять пероральним шляхом. У варiантi здiйснення цього винаходу, якому вiддають перевагу, сполуку Формули I вводять один раз на добу. У iншому варiантi здiйснення цього винаходу, якому віддають перевагу, терапевтичне застосування вiдбувається на людинi. Термiн "фармацевтично прийнятна сiль" у значенні, вживаному у цьому описі, стосується солi сполуки за цим винаходом, яка вважається прийнятною для клiнiчного та/або ветеринарного застосування. Приклади фармацевтично прийнятних солей та загальних методологiй їx одержання можна знайти в "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use" Р. Stahl, et al., 2nd Revised Edition, Wiley-VCH, 2011 та S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66(1), 1-19. Приклади фармацевтичних композицiй i способiв їx одержання можна знайти у "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Loyd, V., et al. Eds., 22nd Ed., Mack Publishing Со., 2012. В одному з варiантiв здiйснення цього винаходу фармацевтичним композиціям може бути надана форма для перорального введення. Переважно фармацевтичним композицiям надана форма таблеток, капсул або розчину. Згадана таблетка, капсула або розчин може мiстити сполуку Формули I в кiлькостi, ефективнiй для лiкування пацієнта, що потребує лiкування. Термiн "ефективна кiлькiсть" означає кiлькiсть або дозу сполуки Формули I або її фармацевтично прийнятної солi, яка при разовому або багаторазовому введеннi дози пацієнту забезпечує бажаний ефект у пацiєнта, якого пiддають дiагностуванню або лiкуванню. Лiкар, що здiйснює лiкування, як фахiвець у цiй галузi, може легко визначити ефективну кiлькiсть шляхом використання вiдомих методик i спостереження результатiв, одержаних за аналогiчних обставин. Фактори, що розглядаються при визначеннi ефективної кiлькостi або дози сполуки, охоплююють: введення згаданої сполуки або її солi; одночасне введення iнших засобiв, у разi їx застосування; вид ссавця, що пiдлягає лiкуванню; його розмiр, вiк i загальний стан здоров'я; ступiнь залучення або тяжкiсть захворювання; реакція конкретного ссавця; спосiб введення; характеристики бiодоступностi введеного лікарського засобу; вибрана схема приймання лікарського засобу; та iншi вiдповiднi обставини. Сполуки за цим винаходом є ефективними при дозi на добу, яка становить вiд приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 15 мг/кг маси тiла. У значеннi, вживаному у цьому описi, термiни "лiкування", "лiкувати" або "курс лiкування" означають уповiльнення, зменшення або змiну напрямку розвитку на протилежний або тяжкiсть наявного симптому, розладу або стану, такого як гiперглiкемiя, що може включати підвищення секретування інсуліну. Сполуки Формули I можуть бути введенi до складу фармацевтичних композицiй, які вводяться будь-яким шляхом, що робить сполуку бiодоступною. Переважно такi композицiї призначенi для перорального введення. Такi фармацевтичнi композицiї та способи їx одержання є добре вiдомими в цiй галузi (Дивись, наприклад, Remington, J.P., "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", L.V. Allen, Editor, 22nd Edition, Pharmaceutical Press, 2012). Сполуки Формули I та їx фармацевтично прийнятнi солі є корисними для терапевтичного застосування за цим винаходом, причому перевагу віддають певним конфiгурацiям. Сполуки за цим винаходом включають: Формула Ia; та Формула Ib або їx фармацевтично прийнятнi солi. Iншi сполуки за цим винаходом включають: Формула ІІа; та Формула ІІb або їx фармацевтично прийнятнi солi. Iншi сполуки за цим винаходом включають: Формула IIIa; та Формула IIIb, або їx фармацевтично прийнятнi солi. Незважаючи на те, що цей винахiд передбачає всi окремi енантiомери, їx сумiшi та рацемати, особлива перевагу вiддають сполукам Формули Ia, Формули ІІа та Формули IIIa та їx фармацевтично прийнятним солям. Окремi енантiомери можуть бути вiдокремленi або роздiленi фахiвцем в цiй галузi в будь-якiй зручнiй точцi у процесi синтезу сполук за цим винаходом вiдомими методами, такими як методи селективної кристалiзацiї, хiральної хроматографiї (дивись, наприклад, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, та E.L. Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994), або надкритичної рiдинної хроматографiї (SFC) (дивись, наприклад, Т.А. Berger; "Supercritical Fluid Chromatography Primer, " Agilent Technologies, July 2015). Фармацевтично прийнятна сiль сполук за цим винаходом може бути одержана, наприклад, шляхом реакцiї сполуки Формули I та вiдповiдної фармацевтично прийнятної основи у прийнятному розчиннику за стандартних умов, добре вiдомих в цiй галузi (дивись, наприклад, Bastin, R.J., et al.; Org. Process. Res. Dev., 4, 427-435, 2000 та Berge, S.M., et al.; J Pharm. Sci., 66, 1-19, 1977). Сiллю, якiй вiддають перевагу, є третбутиламiнова (або ербумiнова) сiль. Деякi абревiатури, вжитi у цьому описi, визначенi вiдповiдно до Daub G.H., et al., "The Use of Acronyms in Organic Chemistry" Aldrichimica Acta, 1984, 17(1), 6-23. Деякi абревiатури визначенi таким чином: "ACN" означає ацетонiтрил; "АТР" означає аденозинтрифосфат; "BSA" означає бичачий сироватковий альбумiн; "сАМР" означає циклiчний аденозин-3',5'-монофосфат; "DCM" означає дихлорметан або метиленхлорид; "DIPEA" означає N, N-дiiзопропiлетiламiн; "DMF" означає N, N-диметилформамiд; "DMSO" означає диметилсульфоксид; "ЕС50" означає концентрацiю засобу, яка викликае 50 % вiдповiдi цiльової·активностi у порiвняннi з заздалегiдь визначеною позитивною контрольною сполукою (абсолютна ЕС50); "ES/MS" означає мас-спектрометрію з електророзпиленням; "EtOAc" означає етилацетат; "НАTU" означає 1-[бiс(диметиламiно)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пiридинiю-3-оксид гексафторфосфату; "НЕК" означає ембрiональну нирку людини; "HEPES" означає 4-(2-гiдроксiетил)-1-пiперазинетансульфонову кислоту; "год." означає годину або години, вiдповiдно; "МеОН" означає метанол або метиловий спирт; "хв." означає хвилину або хвилини; "Pd(dppf)Cl2" означає [1,1'-бiс(дифенiлфосфiно)фероцен]дихлоропаладiй(ІІ); "RT" означає кiмнатну температуру; i "THF" означає тетрагiдрофуран. Сполуки за цим винаходом можуть бути одержанi iз застосуванням рiзноманiтних процедур, деякi з яких проiлюстрованi в наведених нижче Препаративних методиках i Прикладах. Для одержання сполук за цим винаходом або їх солей, конкретнi етапи синтезу для кожного з описаних шляхiв можуть бути скомбiнованi рiзноманiтними способами. Продукт кожного наведеного нижче етапу може бути видiлений традицiйними методами, у тому числі шляхом екстрагування, випарювання, осадження, хроматографування, фiльтрування, розтирання в порошок та кристалiзування. Реагенти та вихiднi матерiали є легко доступними для фахiвця в цiй галузi. Окремi iзомери, енантiомери та дiастереоiзомери можуть бути вiдокремленi або роздiленi в будь-якiй зручнiй точцi у процесi синтезу такими методами, наприклад, як методи селективного кристалiзування або хiрального хроматографування (дивись, наприклад, J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, та E.L. Eliel and S.H. Wilen, " Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994). Без обмеження обсягу цього винаходу, для додаткового iлюстрування винаходу наданi наведенi нижче Препаративнi методики та Приклади. Схема 1 LG - рухома группа R1, R2 та R3 вiдповiдають визначенню, наведеному для Формули I На Схемi 1 показаний синтез промiжного продукту 6, який використовували для одержання сполук Формули I. Бензойну кислоту 1 спочатку пiддавали вiдновленню комплексом диметилсульфiду борану на Етапi 1 для одержання спирту 2. Цей спирт перетворювали на рухому групу (LG, промiжний продукт 3). Наприклад, спирт у промiжному продуктi 2 може бути перетворений на мезилатну групу з використанням метансульфонiлхлориду при -15 °C на Етапi 2 або може бути перетворений на бромiд з використанням трибромiду фосфору при 0 °C. Промiжний продукт 3 реагував з NaCN на Етапi 3 для одержання нiтрилу 4. Нiтрил 4 перетворювали на KОН при пiдвищенiй температурi на Етапi 4 для одержання кислоти 5, яку потiм естерифiкували на Етапi 5 для одержання промiжного продукту 6 з використанням оксалiлхлориду, DMF та метанолу. Схема 2 R1, R2 та R3 вiдповiдають визначенню, наведеному для Формули I На Схемi 2 показане одержання ключового промiжного продукту 12 для одержання сполук Формули I двома шляхами. За першим шляхом арилгалогенiд 6 піддавали одноетапному борилуванню за реакцiею Мiяура/сполученню за реакцiею Сузукi з використанням бiс(пiнаколато)дибору, Pd(dppf)Cl2 та ацетату калiю при пiдвищенiй температурi; арилгалогенiд 6 перетворювали на Етапi 1а на бороновий складний ефiр 7, пiсля чого до реакцiйної сумiшi (Етап 2а) додавали бромпiридин 8 i K2СО3, що дає промiжний продукт 12. За другим шляхом використовували двоетапний процес: сполучення за реакцiєю Сузукi арилгалогенiду 6 з пiнаколовим складним ефiром 6-гiдроксипiридин-2-боронової кислоти 9 з використанням Pd(dppf)Cl2 i K2СО3 при пiдвищенiй температурi (Етап 1b) забезпечувало одержання промiжного продукту 10, який потім алкiлували 4-(бромметил)-3-фторбензонiтрилом 6 з використанням Ag2CO3 при пiдвищенiй температурi (Етап 2b), та одержували промiжний продукт 12. Гiдролiз складного ефiру промiжного продукту 12 на Етапi 3 з використанням LiOH давав кислотний промiжний продукт 13. Схема 3 R1, R2 та R3 вiдповiдають визначенню, наведеному для Формули I Як альтернатива, ключовi промiжнi продукти 12 i 13 можна одержати за Схемою 3, шляхом сполучення бромпiридину 8 зi складним ефiром боронової кислоти 7 або з бороновою кислотою 14 з використанням Pd(dppf)Cl2 i карбонату калiю при пiдвищенiй температурі. Схема 4 R1, R2 та R3 вiдповiдають визначенню, наведеному для Формули I На Схемi 4 показано перетворення ключового промiжного продукту 13 на сполуки Формули I. Сполучення амiду на Етапi 1 з використанням НАTU та дiанiлiну 15 давало промiжний продукт 16. Циклiзацiю (Етап 2) здiйснювали нагрiванням промiжного продукту 16 в оцтовiй кислоті для одержання бензимiдазолу 17. Нарештi, на Етапi 3 сполуки Формули I одержували шляхом гiдролiзу сполуки 17 з використанням LiOH. Препаративнi методики та Приклади LC-ES/MS виконували на системi для рiдинної хроматографїї AGILENT® НР1200. Вимiрювання шляхом мас-спектрометрії з електророзпиленням (здiйснюванi в позитивному та/або негативному режимi) виконували на квадрупольному масспектрометрi з мас-селективним детектором, пiдключеним до системи HPLC, яка може мати або може не мати ELSD. Умови LC-ES/MS (низький рН): колонка: PHENOMENEX® GEMINI® NX С18, 2,0×50 мм, 3,0 мкм, 110 Å; градiєнт: 5-95 % В протягом 1,5 хв, потiм 95 % В протягом 0,5 хв, температура колонки: 50±10 °C; швидкiсть потоку: 1,2 мл/хв; 1 мкл об'єм iн'єкції; Розчинник А: деiонiзована вода з 0,1 % НСООН; Розчинник В: ACN з 0,1 % мурашиної кислоти; довжина хвилi 200-400 нм i 212-216 нм. У разi, якщо система HPLC споряджена ELSD, параметри є такими: температура випарника 45 °C, температура небулайзера 40 °C швидкість потоку газу 1,6 SLM (стандартний лiтр/хвилина). Альтернативнi умови LC-MS (високий рН): колонка: Waters xBridge® С18, 2,1×50 мм, 3,5 мкм; градiєнт: 5-95 % В протягом 1,5 хв, потiм 95 % В протягом 0,50 хв; температура колонки: 50±10 °C; швидкiсть потоку: 1,2 мл/хв; 1 мкл об'єм iн'єкції; Розчинник А: 10 мМ NH4HCО3, рН 9; Розчинник В: ACN; довжина хвилi: 200-400 нм i 212-216 нм; у разi ELSD: температура випарника 45 °C, температура небулайзера 40 °C i швидкiсть потоку газу 1,60 SLM. Порошковi рентгенограми (XRPD) кристалічних твердих речовин одержували із застосуванням порошкового рентгенiвського дифрактометра Bruker D4 Endeavor, спорядженого джерелом CuKa i детектором Vantec, що працює при 35 кВ i 50 мА. Зразок сканували у межах 4-40° кута 2θ з величиною кроку, що дорiвнює 0,008° кута 2θ°, при швидкості сканування 0,5 с/крок, з 1,0 мм розходженням, фiксованим рівнем антирозсіювання 6,6 мм та 11,3 мм дiафрагмами детектора. Сухим порошком наповнювали кварцовий тримач зразка; поверхню розгладжували iз застосуванням предметного скла. Дифрактограми кристалiчної форми одержували при температурi i вiдноснiй вологостi навколишнього середовища. Позиції пiкiв кристалiв визначали в MDI-Jade пiсля зсуву вciєї рентгенограми на основi внутрiшнього стандарту NIST 675 з пiками на 8,853° i 26,774° кута 2θ°. З кристалографїї добре вiдомо, що для будь-якої заданої кристалiчної форми вiдносна iнтенсивнiсть дифракцiйних пiкiв може варiювати унаслiдок переважної орiєнтації, що є наслiдком певних факторiв, таких як морфологiя i форма кристала. У разi присутностi ефектiв переважної орiєнтації, iнтенсивнiсть пiкiв може бути змiнена, однак характеристичнi позицiї пiкiв полiморфних модифiкацiй залишаються незмiнними. Дивись, наприклад, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Окрiм того, з кристалографiї також добре вiдомо, що для будь-якої заданої кристалiчної форми кутовi положения пiкiв можуть дещо варiювати. Наприклад, положения пiкiв можуть зсуватись унаслiдок змiн температури, при якiй аналiзують зразок, змiщення зразка або присутностi чи вiдсутностi внутрiшнього стандарту. У даному разi, несталiсть положения пiкiв ±0,2° кута 2θ° буде враховувати цi потенцiйнi варiацiї без перешкоджання однозначнiй iдентифiкацiї згаданої кристалiчної форми. Пiдтвердження кристалiчної форми може бути здiйснене на основi будь-якої унiкальної комбiнацiї вiдмiнних пiкiв. Препаративна методика 1 (4-Бром-2-фтор-5-метилфенiл)метанол У колбу вносили: 4-бром-2-фтор-5-метилбензойну кислоту (100°г, 421°ммоль), THF (200 мл) i боран (диметилсульфiдний комплекс, 2 моль/л розчин у THF, 210 мл, 10 ммоль). Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом ночi. Реакцiйну сумiш гасили НСl (1,0 N водний розчин, 50 мл), i фiльтрували сумiш. Фiльтрат концентрували in vacuo, i розподiляли залишок мiж EtOAc (400 мл) i водою (400 мл). Органiчну частину промивали насиченим водним розчином NaCl (400 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку у виглядi твердої речовини (93,5 г, 99 %). 1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,29 (d, J=7,9 Гц, 1H), 7,26 (d, J=9,1 Гц, 1H), 4,69 (s, 2Н), 2,38 (s, 3Н). Препаративна методика 2 (4-Бром-2-фтор-3-метилфенiл)метанол Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 1, iз використанням 4-бром-2-фтор-3-метилбензойної кислоти. Продукт очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 10 % до 35 % EtOAc в гексанах. Час утримання пiка LC-ES/MS: 1,01 хв. Препаративна методика 3 2-(4-Бром-2-фтор-5-метилфенiл)ацетонiтрил (4-Бром-2-фтор-5-метилфенiл)метанол (92 г, 420 ммоль) розчиняли у DCM (500 мл), i додавали триетиламiн (120 мл, 861 ммоль). Сумiш охолоджували до -15 °C, i до реакцiйної сумiшi краплями додавали розчин метансульфонiлхлориду (40 мл, 517 ммоль) у DCM (30 мл). Сумiш перемiшували протягом 30 хв при кiмнатнiй температурi. Реакцiйну сумiш розподiляли мiж DCM (500 мл) i водою (500 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaCl (500 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок розчиняли у DMF (400 мл), i сумiш охолоджували на льодянiй банi. До реакцiйно1 сумiшi однiсю порцiсю додавали NaCN (21,0 г, 429 ммоль), i перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом ночi. Сумiш розподiляли мiж EtOAc (400 мл) i водою (500 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaCl (500 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 10 % до 30 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (47,0 г, 48 %) у виглядi масла. 1Н-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,34 (d, J=8,7 Гц, 1H), 7,32 (d, J=8,1 Гц, 1H), 3,71 (s, 2Н), 2,41 (s, 3Н). Препаративна методика 4 2-(4-Бром-2-фтор-3-метилфенiл)ацетонiтрил Змiшували (4-бром-2-фтор-3-метилфенiл)метанол (1,90 г, 8,67 ммоль) i DCM (20 мл). Сумiш охолоджували до 0 °C, потiм краплями додавали трибромiд фосфору (1,0 мл, 11 ммоль). Сумiш перемiшували при 0 °C протягом 15 хв, пiсля чого цю сумiш пiдлуговували насиченим водним розчином NaHCO3 (10 мл). Сумiш екстрагували DCM (40 мл). Органiчнi речовини промивали розсолом (30 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували для одержання твердої речовини. Тверду речовину розчиняли у DMSO (10 мл), потiм додавали NaCN (0,60 г, 13,0 ммоль), i перемiшували протягом 1 год. Сумiш розподiляли мiж EtOAc (50 мл) i водою (50 мл). Органiчнi речовини промивали розсолом (50 мл), сушили над Na2SO4, фiльтрували, концентрували, та одержували продукт у вигляді твердої речовини (1,3 г, 64 %). Час утримання шка LC-ES/MS: 1,17 хв. Препаративна методика 5 Метил-2-(4-бром-2-фтор-5-метилфенiл)ацетат У колбу додавали: 2-(4-бром-2-фтор-5-метилфенiл)ацетонiтрил (1,20 г, 5,10 ммоль), етанол (5 мл), воду (3 мл) i гiдроксид калiю (0,90 г, 16 ммоль). Сумiш грiли при 90 °C протягом ночi. Сумiш охолоджували на льодянiй банi, i додавали 1,0 М розчин HCl для пiдкислювання до рН 4-5, пiсля чого сумiш розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i водою (30 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, концентрували, та одержували 2-(4-бром-2-фтор-5-метилфенiл)оцтову кислоту у виглядi твердої речовини. Одержану тверду речовину розчиняли в DCM (10 мл), потiм додавали DMF (0,05 мл, 0,6 ммоль) i оксалiлхлорид (0,5 мл, 6 ммоль) при кiмнатнiй температурi. Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 30 хв, потiм краплями додавали МеОН (2 мл, 49,4 ммоль). Через 30 хв видаляли розчинник in vacuo, i розподiляли залишок мiж EtOAc (40 мл) i 5 % розчином NaHCO3 (30 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (40 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку у виглядi масла (1,1 г, 80 %). ES/MS m/z (79Br, 81Br) 278,280 (M+NH4+). Препаративна методика 6 Метил-2-(4-бром-2-фтор-3-метилфенiл)ацетат Вказану сполуку одержували по сутi так, як описано у Препаративнiй методицi 5, iз використанням 2-(4-бром-2-фтор-3-метилфенiл)ацетонiтрилу. Час утримування пiка LC-ES/MS: 1,22 хв. Препаративна методика 7 Метил-2-(4-бром-2,6-дифторфенiл)ацетат Змiшували 4-бром-2,6-дифторфенiлоцтову кислоту (3,30 г, 12,5 ммоль), DCM (20 мл), DMF (0,05 мл, 0,6 ммоль) та оксалiлхлорид (1,3 мл, 15 ммоль). Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 30 хв, потiм краплями додавали МеОН (1,5 мл, 37 ммоль, 100 % (мас.)). Сумiш концентрували, i розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i насиченим водним розчином NaHCO3 (15 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку у виглядi масла (3,41 г, кiлькiсний вихiд), яке використовували без додаткового очищения в Препаративнiй методицi 10. ES/MS m/z (79Br, 81Br) 265,267 (М+Н). Препаративна методика 8 4-[(6-Бром-2-пiридил)оксиметил]-3-фторбензонiтрил 2-Брoм-6-фтoрпiридин (2,50 г, 13,8 ммоль) i 3-фтор-4-(гiдроксиметил)бензонiтрил (2,15 г, 13,8 ммоль) розчиняли в 1,4-дiоксанi (25 мл), i краплями протягом 12 хв при кiмнатнiй температурi додавали розчин трет-бутоксиду (20 % (мас.) у THF, 10,0 мл, 16,6 ммоль). Реакцiйну сумiш грiли при 40 °C протягом 30 хв. Згадану сумiш виливали у водний розчин K2СО3 (1М), i двiчi екстрагували EtOAc. Органiчнi речовини промивали водою i насиченим водним розчином NaCl, висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок висушували у вакуумнiй печi при 50 °C, та одержували вказану в заголовку сполуку (4,23 г, 95 %) у виглядi свiтло-жовтої твердої речовини. ES/MS m/z (79Br, 81Br) 307,309 (М+Н). Препаративна методика 9 Метил-2-[2-фтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)-5-метилфенiл]ацетат У колбу додавали пiнаколовий складний ефiр 6-гiдроксипiридин-2-боронової кислоти (1,6 г, 6,9 ммоль), метил-2-(4-бром-2-фтор-5-метилфенiл)ацетат (2,2 г, 8,4 ммоль), THF (15 мл), воду (1 мл) i карбонат калiю (2,0 г, 14 ммоль). Сумiш барботували азотом протягом 10 хв, потiм додавали Pd(dppf)Cl2 (0,26 г, 0,35 ммоль), i грiли при 75 °C протягом 2 год. Сумiш розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i водою (30 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), висушували над Na2SО4, фiльтрували, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку (1,4 г, 74 %) у виглядi твердо'i речовини. ES/MS m/z 276 (М+Н), 274 (М-Н). Препаративна методика 10 Метил-2-[2,6-дифтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)фенiл]ацетат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 9, iз використанням метил-2-(4-бром-2,6-дифторфенiл)ацетату та з нагрiванням реакцiйної сумiшi при 75 °C протягом ночi. ES/MS m/z 280 (М+Н). Препаративна методика 11 Метил-2-[2-фтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)-3-метилфенiл]ацетат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 9, із використанням метил-2-(4-бром-2-фтор-3-метилфенiл)ацетату та з нагрiванням реакцiйної сумiшi при 75 °C протягом ночi (18 год.). ES/MS m/z 276 (М+Н), 274 (М-Н). Препаративна методика 12 Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]ацетат 2-(4-бром-3-метилфенiл)оцтову кислоту (10,7 г, 45,8 ммоль) розчиняли у DCM (50 мл). Сумiш охолоджували на водянiй банi з льодом, шсля чого додавали оксалілхлорид (4,8 мл, 55 ммоль) i DMF (0,1 мл). Водяну баню з льодом видаляли, i перемішували при кiмнатнiй температурi протягом 2 год. Краплями протягом 2 хв додавали МеОН (6,0 мл), i перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 1 год. Реакцiйну сумiш концентрували in vacuo, i залишок розчиняли в EtOAc. Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaHCO3 i насиченим водним розчином NaCl. Органiчнi речовини висушували над Na2SO4, потiм фiльтрували, i концентрували. До залишку додавали бiс(пiнаколато)дибор (12,8 г, 50,4 ммоль) i ацетат калiю (13,6 г, 137 ммоль). Реакцiйну сумiш барботують азотом протягом 15 хв, потiм додавали Pd(dppf)Cl2 (комплекс з DCM, 1,13 г, 1,37 ммоль). Реакцiйну сумiш грiли у атмосферi азоту при 85 °C протягом 15 год. на маслянiй банi, потiм реакцiйну колбу знiмали з масляної банi. Розчиняли карбонат калiю (9,49 г, 68,7 ммоль) у водi (60 мл), одержаний розчин барботували азотом протягом 10 хв, пiсля чого до реакцiйної сумiшi додавали спочатку цей розчин, а потiм 4-[(6-бром-2-пiридил)оксиметил]-3-фторбензонiтрил (14,1 г, 45,8 ммоль). Всю згадану реакцiйну сумiш барботували азотом протягом 5 хв, i грiли у атмосферi азоту при 85 °C протягом 6 год. Реакцiйну сумiш охолоджували до температури близької до кiмнатної, i концентрували in vacuo для видалення бiльшої частини 1,4-дiоксану. Цю сумiш разбавляли EtOAc (200 мл), i промивали водою та насиченим водним розчином NaCl. Органiчнi речовини висушували над Na2SO4, потiм фiльтрували, i концентрували. Неочищений продукт очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 5 % до 50 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (13,3 г, 70 %) у виглядi свiтло-жовтого твердої речовини. ES/MS m/z 391 (М+Н). Препаративна методика 13 Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]ацетат У колбу додавали метил-2-[2-фтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)-5-метилфенiл]ацетат (1,40 г, 5,09 ммоль), 1,4-дiоксан (35 мл), карбонат срiбла (1,7 г, 6,2 ммоль) i 4-(бромметил)-3-фторбензонiтрил (1,4 г, 6,2 ммоль). Сумiш грiли при 60 °C протягом ночi. Тверду речовину вiдфiльтровували, i фiльтрат концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 12 % до 55 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (1,60 г, 77 %) у виглядi твердо1 речовини. ES/MS m/z 409 (М+Н), 407 (М-Н). Препаративна методика 14 Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]ацетат У колбу вносили 4-[(6-бром-2-пiридил)оксиметил]-3-фторбензонiтрил (2,02 г, 6,58 ммоль), метил-2-(2-фтор-4-(4,4,5,5)-тетраметил-1,3,2-дiоксаборолан-2-iл)фенiл)ацетат (2,99 г, 9,88 ммоль), K2СО3 (2,30 г, 16,5 ммоль), 1,4-дiоксан (30 мл) i воду (10 мл). Сумiш барботували азотом протягом 10 хв. До сумiшi додавали комплекс Pd(dppf)Cl2 у DCM (492 мг, 0,658 ммоль), i нагрiвали до 80 °C в атмосферi азоту протягом 5 год. Реакцiйну сумiш охолоджували, розбавляли EtOAc (75 мл), i фiльтрували через шар Celite®. Фiльтрат проминали водою 1 насиченим водним розчином NaCl, висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Одержаний залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi з градiєнтом вiд 5 % до 90 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (2,68 г, 94 %). ES/MS m/z 395 (М+Н). Препаративна методика 15 Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]ацетат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 13, iз використанням метил-2-[2,6-дифтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)фенiл]ацетату таз нагрiванням реакцiйної сумiшi при 80 °C протягом ночi. ES/MS m/z 413 (М+Н). Препаративна методика 16 Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]ацетат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 13, із використанням метил-2-[2-фтор-4-(6-гiдрокси-2-пiридил)-3-метилфенiл]ацетату та з нагрiванням реакцiйної сумiшi при 80 °C протягом 3 год. ES/MS m/z 409 (М+Н). Препаративна методика 17 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]оцтова кислота У колбу додавали метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]ацетат (1,20 г, 3,07 ммоль), ACN (20 мл), воду (10 мл) i гiдроксид лiтiю (0,35 г, 15 ммоль). Сумiш грiли при 45 °C протягом 3 год. Сумiш охолоджували на льодянiй банi, та iз застосуванням 1,0 М розчину HCl пiдкислювали до рН=4-5. Сумiш розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i водою (30 мл). Органiчнi речовини проминали розсолом (30 мл), висушували над Na2SО4, фiльтрували, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку (1,1 г, 95 %) у виглядi твердої речовини. ES/MS m/z 377 (М+Н). Препаративна методика 18 2-[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]оцтова кислота У флакон додавали метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]ацетат (1,6 г, 3,9 ммоль), ACN (20 мл), воду (6 мл) i гiдроксид лiтiю (0,45 г, 19 ммоль). Сумiш грiли при 45 °C протягом 2 год., охолоджували на льодянiй банi, та iз застосуванням 1,0 М розчину HCl пiдкислювали до рН=4-5. Сумiш розподiляли мiж EtOAc (50 мл) i водою (50 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaCl (50 мл), висушували над Na2SО4, фiльтрували, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку (1,55 г, 100 %) у виглядi твердо1 речовини. ES/MS m/z 395 (М+Н). Препаративна методика 19 2-[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]оцтова кислота Метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]ацетат (2,68 г, 6,25 ммоль) розчиняли у THF (50 мл), потiм додавали гiдроксид лiтiю (797 мг, 32,9 ммоль) i воду (20 мл). Пiсля перемiшування при кiмнатнiй температурi протягом 5 годин доводили рН реакцiйної сумiшi до 5 iз застосуванням водного розчину HCl (1M). Леткi розчинники видаляли in vacuo, та одержували водну суспензiю. Тверду речовину вiдфiльтровували, висушували, та одержували вказану в заголовку сполуку (2,24 г, 88 %). ES/MS m/z 381 (М+Н). Препаративна методика 20 2-[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]оцтова кислота Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 18, iз використанням метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]ацетату. ES/MS m/z 399 (М+Н). Препаративна методика 21 2-[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]оцтова кислота Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 17, iз використанням метил-2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]ацетату. ES/MS m/z 395 (М+Н). Препаративна методика 22 2-[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]фенiл]оцтова кислота Змiшували 4-[(6-бром-2-пiридил)оксиметил]-3-фторбензонiтрил (0,70 г, 2,3 ммоль) i 2-(4-борофенiл)оцтову кислоту (0,64 г, 3,4 ммоль), THF (15 мл), воду (5 мл) i карбонат калiю (0,63 г, 4,6 ммоль). Сумiш барботували азотом протягом 10 хв, потiм додавали Pd(dppf)Cl2 (0,085 г, 0,11 ммоль), i сумiш грiли при 75 °C протягом 8 год. Сумiш пiдкисляли до рН 4-5 водним розчином HCl (1 М). Сумiш розподiляли мiж EtOAc (50 мл) i водою (50 мл). Органiчнi речовини проминали розсолом (50 мл), висушували (Na2SO4), потiм фiльтрували, i концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 25 % до 65 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (800 мг, вихiд 97 %) у виглядi твердої речовини. ES/MS m/z 363,0 (М+Н). Препаративна методика 23 Метил-4-амiно-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат До розчину метил-3-фтор-4-нiтробензоату (2,0 г, 10 ммоль) у THF (10 мл) i DMF (10 мл) при кiмнатнiй температурi додавали триетиламiн (3,1 мл, 22 ммоль). До злегка жовтого розчину додавали [(2S)-оксетан-2-iл]метанамiн (Austin Chernical Cornpany, 1,0 г, 11 ммоль), i розчин iржавого кольору перемiшували протягом ночi. Реакцiйну сумiш розбавляли EtOAc (100 мл) i водою (50 мл). Органiчний шар вiдокремлювали, пiсля чого водний шар знову екстрагували EtOAc (2×50 мл). Органiчнi речовини об'єднували, i промивали насиченим водним розчином NaCl. Органiчнi речовини висушували над Na2SO4, фiльтрували, концентрували, i залишок висушували пiд високим вакуумом. Це давало неочищений метил-4-нiтро-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (2,8 г, 10 ммоль) у виглядi жовтої твердої речовини (ES/MS m/z 267 (М+Н)). Далi метил-4-нiтро-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (2,8 г, 10 ммоль) розчиняли у THF (50 мл), i додавали паладiй на вуглецi (5 % попередньо зволожений водою, 0,5 г). Реакцiйну сумiш барботували in vacuo воднем, потiм перемiшували iз застосуванням еластичної камери з воднем пiд тиском при кiмнатнiй температурi протягом 2 год. Протягом цього часу жовтий колiр зникає. Сумiш фiльтрували через Celite®, концентрували, та одержували вказану в заголовку сполуку (2,4 г, 99 %). ES/MS m/z 237 (М+Н). Препаративна методика 24 Метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат У флакон вносили 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]оцтову кислоту (1,10 г, 2,92 ммоль), DMF (10 мл), HATU (1,4 г, 3,6 ммоль), метил-4-амiно-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (0,76 г, 3,2 ммоль) і DIPEA (1,5 мл, 8,6 ммоль). Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 30 хв, потiм розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i водою (30 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), потiм висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 10 % до 35 % EtOAc в DCM, та одержували вказану в заголовку сполуку (1,2 г, 69 %) у виглядi твердої речовини. ES/MS m/z 595 (М+1), 593 (М-1). Препаративна методика 25 Метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат У колбу додавали: 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]оцтову кислоту (1,20 г, 3,04 ммоль), DMF (15 мл), HATU (1,2 г, 3,1 ммоль), метил 4-амiно-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (0,80 г, 3,4 ммоль) i DIPEA (1,5 мл, 8,6 ммоль). Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 30 хв, потiм розподiляли мiж EtOAc (30 мл) i водою (30 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), потiм висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 10 % до 35 % EtOAc в DCM, та одержували вказану в заголовку сполуку у виглядi твердої речовини (1,20 г, 64 %). ES/MS m/z 613 (М+1), 611 (М-Н). Препаративна методика 26 Метил-2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]метил]-3-[[(2S)оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбоксилат У круглодонну колбу вносили 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]оцтову кислоту (205 мг, 0,540 ммоль), метил-4-амiно-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (116 мг, 0,490 ммоль), HATU (224 мг, 0,589 ммоль), DIPEA (0,26 мл, 1,5 ммоль) та DMF (5 мл). Пiсля перемiшування при кiмнатнiй температурi протягом 3,5 год. реакцiйну сумiш розбавляли EtOAc (30 мл), i проминали водою та насиченим водним розчином NaCl. Органiчнi речовини висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок очищали хроматографiєю на силiкагелi iз використанням градiєнта вiд 0 % до 10 % МеОН в DCM, та одержували промiжний амiд (326 мг). ES/MS m/z 599 (М+Н). Одержаний промiжний амiд нагршали з оцтовою кислотою (5 мл) при 50 °C протягом 15 год. Реакцiйну сумiш концентрували in vacuo, i залишок розчиняли у EtOAc (25 мл). Органiчнi речовини промивали насиченим водним розчином NaHCO3 i насиченим водним розчином NaCl. Органiчнi речовини висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Одержаний залишок очищали хроматографiєю на силікагелі із використанням градiєнта вiд 20 % до 100 % EtOAc в гексанах, та одержували вказану в заголовку сполуку (152 мг, 52 %). ES/MS m/z 581 (М+Н). Препаративна методика 27 Метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 24, iз використанням 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]оцтовоi кислоти. Продукт, який випадав в осад пiд час водної обробки, вiдфiльтровували, i використовували без подальшого очищения. ES/MS m/z 617 (М+Н), 615 (М-Н). Препаративна методика 28 Метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 24, iз використанням 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]оцтовоi кислоти. ES/MS m/z 613 (М+Н), 611 (М-Н). Препаративна методика 29 Метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]фенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Препаративнiй методицi 25, із використанням 2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]фенiл]оцтової кислоти. ES/MS m/z 581,0 (М+Н), 579,0 (М-Н). Приклад 1 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонова кислота У флакон вносили метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-3-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (1,2 г, 2,0 ммоль) i оцтову кислоту (6 мл). Сумiш грiли при 80 °C протягом 2 год., потiм видаляли розчинник in vacuo. Залишок роздiляли мiж EtOAc (30 мл) i водним розчином NаНСО3 (5 %, 20 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок розчиняли в ACN (5 мл) i водi (3 мл), потiм додавали до сумiшi LiOH (0,22 г, 9,2 ммоль), i перемiшували при 50 °C протягом 2 год. Розчинник видаляли in vacuo. Залишок очищали флеш-хроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 20 % до 35 % ACN у 5 % водному розчинi NH4HCO3, та одержували вказану в заголовку сполуку (900 мг, 79 %) у виглядi твердої речовини. ES/MS m/z 563 (М+Н), 561 (М-Н). Приклад 2 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонова кислота У флакон вносили метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоат (1,20 г, 1,96 ммоль) i оцтову кислоту (15 мл), потiм грiли сумiш при 80 °C протягом 2 год. Розчинник видаляли in vacuo. Залишок роздiляли мiж EtOAc (30 мл) i водним розчином NaHCO3 (5 %, 20 мл). Органiчнi речовини проминали насиченим водним розчином NaCl (30 мл), висушували над Na2SO4, фiльтрували, i концентрували. Залишок розчиняли в ACN (10 мл) i водi (4 мл), потiм додавали до сумiшi LiOH (0,24 г, 10 ммоль), i перемiшували при 50 °C протягом 2 год. Сумiш пiдкисляли насиченим водним розчином лимонної кислоти до рН=4-5. Розчинник видаляли in vacuo. Залишок очищали флешхроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 20 % до 35 % ACN у 5 % водному розчинi NН4НСО3, та одержували вказану в заголовку сполуку (745 мг, 66 %) у виглядi твердої речовини. ES/MS m/z 581 (М+Н), 579 (М-Н). Приклад 2а трет-Бутиламонiй-2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбоксилат Метод 1 - Препаративна методика без кристалу-зародка 2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонову кислоту (555 мг, 0,96 ммоль) суспендували в ацетонi (6 мл) при перемiшуваннi при 800 об/хв при 50 °C, та одержували суспензiю бiлої твердої речовини. Додавали трет-бутиламiн (115 мкл, 1,09 ммоль, 1,14 екв.), спостерiгаючи за коротким освiтленням сумiшi з подальшим осадженням бiлої твердої речовини. Цю суспензiю перемiшували при 50 °C протягом 1 год., потiм припиняли нагрівання, залишали зразок при перемiшуваннi доти, доки вiн не досягне кiмнатної температури. Тверду речовину вiдфiльтровували вакуумним фiльтруванням, i сушили на мiсцi протягом 15 хв пiд струменем азоту, потiм сушили in vacuo при 50 °C протягом 1 год., та одержували вказану в заголовку сполуку (612 мг, 98 %). Метод 1 - Препаративна методика без кристалу-зародка Змiшували 2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонову кислоту (50 г, 86,1 ммоль), ацетон (658 мл) i воду (42 мл), i сумiш нагрiвали до 50 °C. Сумiш фiльтрували через папiр GF/F, i проминали сумiшшю ацетон:вода (94:6 (у об'ємному вiдношеннi), 25 мл). Одержаний розчин грiли при 50 °C. Готували розчин трет-бутиламiну (10 мл, 94,7 ммоль, 1,1 екв.) i сумiшi ацетон:вода (94:6 (у об'ємному вiдношеннi), 25 мл). Додавали порцiю розчину трет-бутиламiну (7 мл), пiсля чого кристали-зародки третбутиламонiй-2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбоксилату (50 мг). Додавали решту розчину трет-бутиламiну протягом приблизно 1 год. iз застосуванням шприцевого насоса зi швидкiстю 0,47 мл/хв. Одержану суспензiю грiли при 50 °C протягом 2 год., потiм сумiш охолоджували до температури навколишнього середовища протягом ночi. Суспензiю фiльтрували, i проминали ацетоном (2×100 мл). Вологий вiдфiльтрований осад сушили при 50 °C in vacuo до постiйної маси, та одержували вказану в заголовку сполуку (51,8 г, 92 %) у виглядi блiдо-жовтої твердої речовини. Пiдготовлений зразок вказаної в заголовку сполуки характеризували порошковою рентгенограмою з використанням СuKα-випромiнення як такий, що має дифракцiйнi пiки (значения 2-тета), як описано в наведенiй нижче Таблицi 1, i, зокрема, має пiки при 6,9 у поєднаннi з одним або кiлькома пiками, вибраними з групи, яку складають 16,3 i 22,5; з допуском на кути дифракцiї 0,2 градуса. Таблиця 1Пiки порошкової рентгенограми трет-бутиламонiй-2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-5-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбоксилатуПiкКут(°2-тета) ±0,2°Вiдносна iнтенсивнiсть(% найбiльш iнтенсивного пiка)15,526,20 %26,964,90 %311,249,20 %416,3100,00 %517,134,70 %619,653,00 %721,843,10 %822,593,80 %927,341,10 %1028,037,90 % Приклад 3 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]метил]-3-[(2S)-оксетан-2-iлметил]бензимiдазол-5-карбонова кислота Метил-2-[[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фторфенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбоксилат (152 мг, 0,256 ммоль) розчиняли у THF (6 мл), потiм додавали гiдроксид лiтiю (31 мг, 1,26 ммоль) i воду (2 мл). Сумiш перемiшували при кiмнатнiй температурi протягом 16 год., потiм рН доводили до 6 додаванням водного розчину HCl (1N). THF видаляли in vacuo, i решту твердої речовини вiдфiльтровували. Очищали флеш-хроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 10 % до 40 % ACN у водному розчинi NН4HCO3 (10 мМ, рН 10), та одержували вказану в заголовку сполуку (60 мг, 41 %). ES/MS m/z 567 (М+Н). Приклад 4 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]метил]-3-[(2S)оксетан-2-iлметил]бензимiдазол-5-карбонова кислота Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Прикладi 1 із використанням метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2,6-дифторфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоату. Продукт очищали флеш-хроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 30 % до 50 % ACN у водному розчинi NH4HCO3 (10 мМ, рН 10). ES/MS m/z 585 (М+Н), 583 (М-Н). Приклад 5 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]метил]-3-[[(2S)оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонова кислота Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Прикладi 2 iз використанням метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]-2-фтор-3-метилфенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоату. Продукт очищали флеш-хроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 5 % до 40 % ACN у 5 % водному розчинi NH4HCO3. ES/MS m/z 581 (М+Н), 579 (М-Н). Приклад 6 2-[[4-[6-[(4-Цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]фенiл]метил]-3-[[(2S)-оксетан-2-iл]метил]бензимiдазол-5-карбонова кислота Вказану в заголовку сполуку одержували по сутi так, як описано в Прикладi 1 iз використанням метил-4-[[2-[4-[6-[(4-цiано-2-фторфенiл)метокси]-2-пiридил]фенiл]ацетил]амiно]-3-[[(2S)-оксетан-2-iлметил]амiно]бензоату. Неочищений продукт очищали флеш-хроматографiєю з оберненою фазою iз використанням градiєнта вiд 20 % до 35 % ACN у 5 % водному розчинi NH4HCO3. ES/MS m/z 549,0 (М+Н), 547,1 (М-Н). Бiолоriчнi дослiдження Аналiз сАМР у клiтинах лiнїї НЕK293, що експресуе рецептори GLP-1 людини Функцiональну активнiсть рецептора GLP-1 визначали iз використанням утворення сАМР в клональнiй клiтиннiй лiнїї НЕK293, що експресуе людський GLP-1R (номер депонування NCBI NP_002053), при густинi експресїї 581±94 фмоль/мг (n=6) i 104±12 фмоль/мг (n=5) бiлка (визначено iз використанням дослiдження гомологiчного конкурентного зв'язування [125I]GLP-1(7-36)NH2). Клiтини, що експресують рецептор hGLP-1R, обробляли сполукою (20-точкова крива залежностi "концентрацiя-ефект" у DMSO, 2,75-кратне пряме розведення Labcyte Echo, 384-лунковий планшет (Coming, номер за каталогом 3570) у DMEM (Gibco, номер за каталогом 31053), з додаванням 1X GlutaMAX™ (Gibco, номер за каталогом 35050), 0,1 % казеїну великої рогатої худоби (Sigma, C4765-10ML), 250 мкМ IBMX (3-iзобутил-1-метилксантин, Acros, номер за каталогом 228420010) i 20 мМ HEPES (Gibco, С15630) у 20 мл аналiтичному об'ємi (кiнцева концентрацiя DMSO 0,5 %). Пiсля 30-хвилинного iнкубування при 37 °C одержане збiльшення внутрiшньоклiтинного сАМР кiлькiсно визначали iз застосуванням набору для дослiдження CisBio сАМР Dynamic 2 HTRF (62AM4PEJ). Стисло, рiвнi сАМР в клiтинi визначають шляхом додавання спочатку кон'югату cAMP-d2 у буфер для лiзису клiтин (10 мкл), а потiм антитiла проти cAMP-Eu3+-Cryptate, також у буфер для лiзису клiтин (10 мкл). Одержану сумiш для конкурентного дослiдження iнкубували протягом щонайменше 60 хв при кiмнатнiй температурi, потiм детектували iз застосуванням приладу PerkinElmer Envision® зi збудженням при 320 нм i випромiненням при 665 нм i 620 нм. Одиницi Envision (випромiнення при 665 нм/620 нм·10000) є обернено пропорцiйними кiлькостi наявного сАМР, i її перетворювали на нМ сАМР на лунку з використанням стандартної кривої сАМР. Кiлькiсть утвореного сАМР (нМ) у кожнiй лунцi перетворювали на вiдсоток вiд максимальної реакцiї, що спостерiгалася з людським GLP-1(7-36)NH2. Вiдносне значения ЕС50 i вiдсоток верхньої межi (Emax) виводили iз застосуванням нелiнiйного регресiйного аналiзу з використанням вiдсотка максимальної реакцiї в порівнянні з концентрацiєю доданої сполуки, підігнаного до чотирипараметричного логiстичного рiвняння. Данi ЕС50 i Emax, у разi тестування сполук Прикладiв 1-6 в описаному вище дослiдженнi сАМР з використанням клiтин НЕK293, що експресують 581 фмоль/мг i 104 фмоль/мг GLP-lR, наведенi в Таблицi 2 i Таблицi 3, вiдповiдно. Цi данi вказують на те, що сполуки Прикладiв 1-6 є агонiстами рецептора GLP-1 людини. Таблиця 2Лiнiя клiтин НЕK293 з густиною експресiiGLP-1R 581 фмоль/мг, внутрiшньоклiтинна вiдповiдь сАМРПрикладEC50 (нМ)±SЕМ (n)Emax (%)±SEM (n)19,33±1,36 (n=6)99,5±2,53 (n=6)21,14±0,315 (n=6)104±4,35 (n=6)33,08±0,379 (n=5)99±3,69 (n=5)43,99±0,378 (n=3)99,2±4 (n=3)56,45±0,934 (n=3)105±2,43 (n=3)620±6,51 (n=4)101±3,42 (n=4) Таблиця 3Лiнiя клiтин НЕK293 з густиною експресiiGLP-1R 581 фмоль/мг, внутрiшньоклiтинна вiдповiдь сАМРПрикладЕС50 (нМ)±SЕМ (n)Emax (%)±SEM (n)120±3,25 (n=6)71,4±2,26 (n=6)23,97±0,61 (n=6)79,2±3,2 (n=6)310±2,3 (n=5)81,7±3,86 (n=5)49,59±2,36 (n=3)78,3±5,1 (n=3)523,6±5,43 (n=3)76,7±3,88 (n=3)647,7±17,9 (n=4)80,3±3,1 (n=4) Внутрiшньоочеревинна проба на толерантнiсть до глюкози in vivo у мишей, нокаутованих за GLP-1R Активнiсть наведених у прикладах сполук щодо зниження концентрацiї глюкози в крою in vivo визначали з використанням мишей, якi експресують людський GLP-1R (номер депонування NCBI NP_002053) з генетичного локусу Gдp-Іr мишi (Jun, L.S., et al., PLoS One. 2014 9:е93746). Мишам, якi голодували протягом ночi, перорально вводили дослiджувану сполуку, розчинену в 10 % Kolliphor® (HS15) у полiетиленглiколi 400 (PEG400). Через годину пiсля введення дози тваринам вводили глюкозу шляхом внутрiшньоочеревинної iн'єкцiї (2 г/кг), i рiвень глюкози в кровi перiодично вимiрювали протягом подальших двох годин iз застосуванням глюкометрiв. Визначали дiапазон доз дослiджуваної сполуки, для кожної групи доз визначали площу пiд кривою, i пiдганяли до чотирипараметричної логiстичної моделi для обчислення активностi in vivo як ED50 з 95 % довiрчим iнтервалом. Пiд час тестування за описаною вище внутрiшньоочеревинною пробою на толерантнiсть до глюкози in vivo, сполуки Прикладiв 1-3 демонстрували здатнiсть знижувати концентрацiю глюкози в кровi у мишей, якi експресують людський GLP-1R, зi значениями ED50 (i 95 % довiрчим iнтервалом), як показано в Таблицi 4, що свiдчило про те, що цi сполуки являли собою доступнi для перорального прийому сильнодiйнi агонiсти GLP-1R у мишей. Таблиця 4Ефективнiсть зниження рiвня rлюкози в кровi у мишей, що експресують людський GLP-1RПрикладED50, що знижує рiвень глюкози у кровi (мг/кг)95 % довiрчий iнтервал10,090,0301-0,259220,070,0246-0,180830,060,013-0,246 Фармакокiнетика у приматiв, якi не є людиною (NHP) Дослiджувану сполуку вводили самицям макак-крабоїдiв натщесерце внутрiшньовенним шляхом (IV) у дозi 0,5 мг/кг (iз використанням об'єму дози 1 мл/кг). Серiйнi зразки кровi вiдбирали через 0,08 год., 0,25 год., 0,5 год., 1 год., 2 год., 4 год., 8 год., 12 год. та 24 год. пiсля введення внутрiшньовенного болюсу. Пiсля обробки коагулянтом EDTА плазму одержували шляхом центрифугування, i зберiгали при -70 °C до дослідження із застосуванням LC-MS/MS. Концентрацiю досліджуваного препарату визначали у плазмi. Для обчислення плазмового клiренсу та об'єму розподiлу в рiвноважному станi використовували некомпартментальний аналiз. У Таблицi 5 наведенi фармакокiнетичнi данi для сполук Прикладiв 1-3 у цьому дослiдженнi. Цi данi, частково, використовували для iнформування людських механiстичних прогнозiв фармакокiнетики, якi припускають фармакокiнетичний профiль для пiдтримки дозування людини один раз надобу. Таблиця 5Фармакокiнетичнi данi макак-крабоїдiвПрикладПлазмовий клiренс (мл/хв/кг)Об'єм розподiлу (л/кг)Носiй*1131,2А2111,1А361,1в* Носій А - 5 % DMSO і 95 % (20 % CAPТISOL® (у відношенню маси до об'єму) у водi; Носiй В - 20 % CAPТISOL® (у вiдношеннi маси до об'єму) у водi+1 моль еквiваленту NaOH) Дослiдження активностi ферменту фосфодiестерази 10 (PDE10) Для одержання бiлка фосфодiестерази 10A1 (PDE10A1) непроцесований клон PDE10A1, що вiдповiдає номеру депонування GenBank AAD32595.1, клонували в pFastВac1 (Invitrogen). Бiлок PDE10A1 з С-кiнцевою мiткою FLAG експресували бакуловiрусною iнфекцiєю клiтин комах, очищали з використанням анти-FLАG М2-агарози (Sigma) та ексклюзивної гель-хроматографії за розмiром молекул на колонцi Superdex 200 (GE Healthcare), i зберiгали при -80 °C у невеликих алiквотах (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 10 % глiцерину). Активнiсть ферменту PDE10A1 визначали із застосуванням сцинтиляцiйного аналiзу з використанням МIПiв (МIП - молекулярно iмпринтований полiмер) на основi силiкату iтрiю (SPА), який виявляє радiоактивнi нуклеотиднi монофосфати, але не циклiчнi монофосфати. Буфер для дослiдження складався з 50 мМ Трис-НСl, рН 7,5, 8 мМ MgCl2, 3,4 мМ EDTА i 0,1 % BSA (Sigma). Дослiдження проводили у 384-лункових планшетах (3706, Corning) в загальному об'ємi 50 мкл: якi вмiщували 24 мкл ферменту PDE10A1, 1 мкл дослiджуваної сполуки та 25 мкл циклiчного нуклеотиду. Дослiджуванi сполуки розводили у чистому DMSO з використанням десятиточкової кривої залежностi "концентрацiя-ефект" з 3-кратним коефiцiєнтом розведення, i 1 мкл розливали у планшети для дослiдження iз застосуванням акустичної системи Echo555 (LabCyte). 24 мкл бiлка PDE10A1 iнкубували з 1 мкл сполуки протягом 30 хв перед початком реакції шляхом додавання субстрату [8-3H]-cGMP (6,5 Кi/ммоль, Perkin Elmer). Кiнцева концентрацiя компонентiв становила 70 пМ PDE10A1, 80 нМ (3H-cGMP) i 2 % DMSO в буферi для дослiдження. Максимальна концентрацiя сполуки в реакцiйнiй сумiшi становила 10 мкМ. Реакцiйнi сумiшi iнкубували протягом 60 хв при кiмнатнiй температурi перед гасiнням i додаванням 400 мг/лунка SРА-гранул (RPNQ0150, Perkin Elmer). Радiоактивнiсть, зв'язану з гранулами (продукт), кiлькiсно визначали через 12 год. iз застосуванням лiчильника Microbeta (Perkin Elmer). Данi нормалiзували на % iнгiбування, а значения IC50 обчислювали з використанням чотирипараметричного логiстичного рiвняння, як описано (Campbell, R.M.; Dymshitz, J.; Eastwood, B.J.; et al. "Data Standardization for Results Management." In: Sittampalam, G.S.; Grossman, А.; Brimacombe, K.; et al.; eds. Assay Guidance Маnuаl. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004.). У Таблицi 6 показана активнiсть сполук Прикладiв 1-4 у цьому дослiдженнi. Цi данi показали, що сполуки Прикладiв 1-4 мали слабку спорiдненiсть зв'язування з PDE10A, що вказувало на знижений ризик токсичностi. Таблиця 6In vitro активнiсть iнriбування PDE10A1ПрикладIC50 (мкМ), n=11>1027,433>1045,41 Дослiдження афiнности зв'язування радiолiганду з каналом hERG K+ людини Спорiдненiсть сполук до K+-каналу hERG людини в трансфiкованих клітинах НЕK-293 оцiнювали iз застосуванням дослiдження зв'язування радiолiганду, як описано нижче. Гомогенати клiтинних мембран (приблизно 40 мкг бiлка) iнкубували протягом 60 хв при 22 °C з 3 нМ [3Н]дофетилiду за вiдсутностi або у присутностi дослiджуваної сполуки в буферi, що мiстив 50 мМ Трис-НСl (рН 7,4), 10 мМ KCl i 1 мМ MgCl2. Дослiдження проводили у 96-лунковому планшетi з об'ємом 200 мкл, який мiстить максимум 1 % DMSO вiд початкової солюбiлiзацiї дослiджуваної сполуки. Пiсля iнкубування зразки швидко фiльтрували пiд вакуумом через скловолоконнi фiльтри (GF/B, Packard), попередньо зволоженi 0,3 % PEI i декiлька разiв промитi крижаним 50 мМ TrisHCl, 10 мМ KCl i 1 мМ MgCl2 iз застосуванням харвестеру клiтин на 96 зразкiв (Unifilter, Packard). Фiльтри сушили, а потiм пiдраховували радiоактивнiсть сцинтиляцiйним шчильником (Topcount, Packard) з використанням сцинтиляцiйного коктейлю (Microscint О, Packard). У Таблицi 7 показана активнiсть сполук Прикладiв 1-3 у цьому дослiдженнi, виражену у вiдсотках iнгiбування специфiчного зв'язування контрольного радiолiганду. Цi данi показали, що сполуки Прикладiв 1-3 мали слабку iнгiбiторну активнiсть hERG, що вказувало на знижений ризик токсичностi. Таблиця 7Вiдсоток iнгiбування спорiдненостi радiолiганду з K+ каналом hЕRG людиниПрикладВiдсоток iнгiбування (%) при 100 мкМ концентрацiї сполуки, n=110254337